一株野生絲蓋冬菇菌株的鑒定及其生物學特性*

耿 軍，徐 剛，劉 萍，劉 曉

（淄博市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 淄博 255033）

絲蓋冬菇（Flammulina velutipes） 屬擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌目 （Agaricaies） 口蘑科 （Trichofonataceae） 冬菇屬 （Flammulina）[1-3]。2018 年 2月6日在對淄博市魯山野生食用菌資源調(diào)查時，從君遷子樹（Diospyros lotus L.）近地枯木上首次采集到野生子實體，組織分離法獲得純菌絲，并在實驗室內(nèi)人工栽培獲得子實體。

1 子實體形態(tài)特征

采集的野生子實體經(jīng)組織分離，在實驗室內(nèi)人工栽培，獲得子實體，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心采用rDNA-ITS區(qū)序列分析法鑒定為絲蓋冬菇變種（Flammulina velutipes var.filiformis），其野生形態(tài)特征見圖1。

圖1 絲蓋冬菇變種野生子實體Fig.1 Fruiting body of wild Flammulina velutipes var.filiformis

由圖1所示，絲蓋冬菇變種（Flammulina velutipes var.filiformis）野生子實體棕色至黃棕色，叢生，菌蓋直徑3.0 cm～6.0 cm，菌柄粗短，菌蓋表面粘液豐富。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 野生子實體

子實體于2018年2月6日采自山東省淄博市博山區(qū)池上鎮(zhèn)魯山山脈，海拔355 m，君遷子樹根部枯木上，從覆雪層長出。

2.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。用于組織分離和母種制備[5]。

原種、栽培種培養(yǎng)料：棉籽皮78%、麩皮20%、蔗糖1%、石灰1%，料水比1.0∶1.3。原種采用750 mL塑料瓶，栽培種采用17 cm×30 cm聚丙烯菌種袋。培養(yǎng)料經(jīng)滅菌、接種后，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)[5]。

2.2 分離純化

采用組織分離法得到野生子實體的PDA純培養(yǎng)物。

2.3 鑒定

菌落和顯微特征：基于野生子實體宏觀和顯微形態(tài)特征觀察，對該菌株進行形態(tài)學初步鑒定。野生子實體采集后，表面消毒，取菌柄與菌蓋交界處的菌肉組織，接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，獲得純菌絲（編號ZJ-16）。觀察野外采集子實體的形態(tài)特征，記錄菌蓋大小、顏色、形狀、質(zhì)地，菌褶著生方式，菌柄著生方式等。將菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、菌絲顏色，顯微鏡下觀察菌絲和鎖狀聯(lián)合情況，進行形態(tài)學鑒定。

rDNA-ITS區(qū)序列分析：將菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，刮取菌絲體，利用CTAB法提取基因組DNA，送中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心采用rDNA-ITS區(qū)序列分析法測序。

2.4 生物學特性測定

2.4.1 菌絲最適生長溫度測定

用打孔器在菌落邊緣取相同菌齡、直徑5 mm的菌絲餅，接種于PDA平板培養(yǎng)基上，分別于10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃溫度下培養(yǎng)，5 d后測量菌落直徑，計算菌絲生長速度（mm·d-1）。每處理重復(fù)5次。菌絲生長速度（V，mm·d-1）的計算公式為：

式中：S1為菌落直徑（mm）；S2為接種塊直徑（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

2.4.2 菌絲生長最適pH測定

用打孔器在菌落邊緣取相同菌齡、直徑5 mm的菌絲餅，接種于pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11、12的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑。每處理重復(fù)5次。

2.4.3 出菇最適溫度測定

使用17 cm×30 cm菌種袋制作栽培種（裝干料400 g），菌絲長滿后，搔菌處理，菌絲在25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d，使菌絲恢復(fù)，置于-8.0℃、-5.0℃、-2.0℃ 、 0℃ 、 5.0℃ 、 10.0℃ 、 15.0℃ 、 20.0℃ 、22.5℃、25.0℃、28.0℃人工氣候箱內(nèi)，濕度85%～95%，每天光照6 h，光照強度300 lx。每處理50袋，每處理重復(fù)3次。觀察出菇情況，按以下公式計算生物轉(zhuǎn)化率（R，%）：

式中：Y為產(chǎn)量（kg）；W為培養(yǎng)料干重（kg）。

3 結(jié)果與分析

3.1 鑒定結(jié)果

野生子實體菌絲及擔孢子顯微特征見圖2。野生子實體由菌蓋、菌褶、菌柄組成，菌蓋半球形，直徑3.0 cm～6.0 cm，棕色至黃棕色，表面有較多粘液，光滑無毛，邊緣內(nèi)卷，菌肉白色至淺黃色，菌褶淺棕色。菌柄近圓形，中生，長1.8 cm～6.5 cm，圓柱狀，直徑0.6 cm～1.5 cm，實心，淺棕色。菌肉細膩，味道鮮美，無纖維絲，優(yōu)于目前人工栽培的其他冬菇品種。

圖2 菌絲及擔孢子顯微特征Fig.2 Microscopic characteristics of mycelium and basidiomycetes

由圖2可知，在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌絲呈白色。子實體顯微觀察發(fā)現(xiàn)，其擔子果叢生，擔孢子橢圓形，表面光滑，擔子近棍棒狀，透明；側(cè)生囊狀體燒瓶形至一側(cè)膨出。其ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于rDNA-ITS基因片段的系統(tǒng)發(fā)育圖Fig.3 Phylogenetic diagram based on rDNA-ITS gene fragments

由圖3所示，菌株ZJ-16所測得的rDNA-ITS基因片與已發(fā)表的冬菇屬（Flammulina）相近種的序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示ZJ-16與Flammulina velutipes var.filiformis的模式菌株HKAS3890穩(wěn)定聚在一起，因此鑒定該菌株為絲蓋冬菇變種（Flammulina velutipes var.filiformis）。

3.2 生物學特性測定結(jié)果

3.2.1 菌絲生長溫度測定結(jié)果

菌絲在不同溫度下的生長情況見表1。

由表1試驗結(jié)果表明，絲蓋冬菇變種菌絲在16℃～30℃均可生長，生長最適溫度24℃～26℃，該溫度下其菌絲日平均生長速度為7.9 cm～8.3 cm，菌絲潔白，粗壯，長勢良好。

表1 菌絲在不同溫度下生長情況Tab.1 Growth of mycelium at different temperatures

3.2.2 菌絲生長pH測定結(jié)果

冬菇變種菌絲在不同pH下的生長情況見表2。

由表2可知，絲蓋冬菇變種菌絲在pH為4～12均能生長，在pH為6～7的環(huán)境下菌絲生長較快，當pH超過10時，菌絲生長迅速下降，其適宜pH為6～7，在此范圍內(nèi)菌絲生長速度快，菌絲濃密，長勢旺。

表2 菌絲在不同pH下生長情況Tab.2 Growth conditions of mycelium at different pH

3.2.3 出菇最適溫度測定結(jié)果

冬菇變種不同溫度下的出菇情況見表3。

表3 不同溫度下出菇情況Tab.3 Fruiting at different temperatures

由表3試驗結(jié)果表明，絲蓋冬菇變種在-2℃～20℃條件下均可出菇，其中10℃～15℃出菇良好，子實體生長旺盛，品質(zhì)優(yōu)，從現(xiàn)蕾到采收約15 d～20 d。

3.2.4 栽培子實體形態(tài)

冬菇變種栽培子實體形態(tài)見圖4。

由圖4可知，人工栽培子實體開始呈黃棕色，后呈黃褐色，柄長10 cm～18 cm，菌蓋直徑1.5 mm～3.0 mm，子實體簇生，表面光滑，有粘液，底部易變褐色。培養(yǎng)過程中，菌蓋不易開傘。與野生子實體相比，人工馴化子實體的顏色稍淺，菌蓋直徑變小，菌柄長度增加。

圖4 絲蓋冬菇變種栽培子實體Fig.4 Cultivated fruiting body of Flammulina velutipes var.filiformis

4 討論

我國冬菇屬食用菌資源豐富，馴化菌株分為黃色和白色2個品系[4]。目前我國工廠化金針菇栽培品種主要是白色品系。近幾年，黃色金針菇已占有一定的市場份額，銷售價格高于白色金針菇[6]。在淄博市魯山食用菌資源考察中采集到的野生絲蓋冬菇變種屬于黃色金針菇品系，其菌絲生長最適溫度24℃～26℃，最適pH為6～7，在此范圍內(nèi)菌絲生長速度快，菌絲濃密，長勢旺；出菇溫度-2℃～20℃，最適溫度10℃～15℃。在適宜環(huán)境條件下，使用78%棉籽殼、20%麩皮、1%石灰、1%蔗糖、130%水的配方進行人工栽培，生物轉(zhuǎn)化率為82.5%～85.3%。該菌株具有出菇早、適應(yīng)溫度廣、菇質(zhì)脆嫩、爽滑可口等優(yōu)良性狀，菌株遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，子實體農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有重要的開發(fā)利用價值。