楊樹口蘑菌種分離和馴化*

孟慶國，池景良，朱巍巍

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

楊樹口蘑（Tricholoma populinum J.Lange） 也稱地摳、老頭扣、地拱子，是口蘑屬（Tricholoma）中一種野生食用菌，生長于楊樹（Populus L.）林。其子實體較大，菌蓋直徑4 cm～15 cm，扁半球形至平展，邊緣內卷波狀，粘，淺紅褐色，趨向邊緣色淺，氣味香，主要分布于中國內蒙古、河北、山西、黑龍江等[1]。其味道鮮美，營養豐富，香味濃郁，肉質滑嫩，深受消費者喜愛，一直是國內熱銷的野生食用菌產品之一，目前沒有人工馴化成功的報道。近年來由于人們過度采收，生態環境遭到破壞，自然生長的楊樹口蘑產量逐年降低。因此，保護野生楊口蘑資源以及進行楊樹口蘑的人工馴化栽培已經迫在眉睫。楊樹口蘑市場價格鮮菇20元/kg，價格和野生紅菇相當，一旦栽培成功，市場前景廣闊。通過介紹楊樹口蘑的菌種分離和馴化技術，以期為實現楊樹口蘑的大規模人工栽培奠定基礎。

1 楊樹口蘑采集

秋季8月～10月雨后，在遼寧省朝陽縣、內蒙古自治區敖漢等地楊樹林中采集到野生楊樹口蘑，見圖1（圖片由趙英同提供）。

如圖1所示，楊樹口蘑叢生，因此當發現一個子實體后就能夠判斷附近還有多個子實體存在，與其相鄰的地方有時候也有。這種生長現象被稱為“蘑菇盤”，今年采摘后，第2年在相同的方依舊會有子實體生長。

圖1 楊樹林與楊樹口蘑Fig.1 Populus L.forest and Tricholoma populinum

2 菌種分離與純化

2.1 培養基

PDA楊樹葉培養基：馬鈴薯200 g、楊樹葉100 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g～20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。將土豆、楊樹葉用小火煮沸30 min，然后用6層紗布過濾。加入其他成分繼續加熱并攪拌至全部溶化后，停止加熱，補足水分。將培養基裝入500 mL三角瓶中，每瓶裝200 mL，115℃滅菌30 min后，在無菌條件下將培養基倒入平皿中（每個平皿約20 mL），冷卻備用。

2.2 組織分離

從采集的楊樹口蘑子實體樣品中，選擇長勢好、菇形完整、中等偏大、肉厚、孢子未彈射、無病蟲害的子實體，在無菌環境進行組織分離，見圖2。

圖2 楊樹口蘑子實體組織分離Fig.2 Isolation of fruiting body tissue of Tricholoma populinum

如圖2所示，子實體表面用75%酒精棉球擦拭消毒，然后放在滅好菌的平皿中。用手術刀切開子實體，在菌蓋或菌柄內側用無菌手術刀或尖嘴鑷子取1 cm見方組織塊接于培養皿的培養基上，然后用封口膜封口。

由于楊樹口蘑的菌種分離難度較大，在組織分離過程中，一定要選好目標子實體。有蟲害、含水量過高、老化的菇體都不應選用，否則組織分離很難成功。最好選用菇體未開傘的幼菇，生命力強不易感染雜菌。

2.3 培養

將培養皿放入溫箱22℃恒溫培養，5d～7d后組織塊萌發。待菌落長到約2cm，用接種針選取最優菌落的尖端菌絲接入新培養基上，進行尖端脫毒，見圖3。

圖3 斷橋法純化Fig.3 Bridge breaking purification

如圖3所示，在無菌條件下，采用斷橋脫毒法用接種針把平皿培養基中間培養基斷開1 cm，把菌種接在斷開培養基一側，菌絲穿越斷開處，伸入前端的培養基上，可以純化菌種。將純化的楊樹口蘑菌種轉接到試管斜面培養基上，放入22℃恒溫箱內繼續培養，12 d～15 d后得到楊樹口蘑純化菌種。

在培養基的選擇上除采用PDA楊樹葉培養基外，還可采用楊樹葉培養基（楊樹葉80%、麩皮18%、糖1%、石膏1%），見圖4。

圖4 楊樹葉培養基接種Fig.4 Poplar leaf culture medium inoculation

如圖4所示，具體方法是將組織塊接入瓶中楊樹葉培養基中或平皿中楊樹葉培養基中，采用這種方法組織塊也可萌發生長。

2.4 菌絲微觀形態觀察

插片培養法是實驗室觀察真菌形態的一種基本方法。用干凈的鑷子，將無菌的蓋玻片以45°的角度斜插入培養基中，插片位置與接種塊之間距離一般為1.0 cm～1.5 cm，見圖5。

圖5 插片法Fig.5 Insertion method

如圖5所示，待菌絲鋪展開來，長過插片的位置后，即可取出玻片進行觀察，見圖6。

圖6 楊樹口蘑菌絲Fig.6 Hyphae of Tricholoma populinum

如圖6所示，菌絲粗壯、豐滿、均勻，并具有鎖狀聯合。

3 液體菌種的制作

3.1 培養基配方

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、維生素B11片，pH 6.8～7.0，水 1 000 mL。

3.2 培養基制作

將土豆用小火煮沸30 min（標準為熟而不爛），然后用6層紗布過濾，將濾液倒入鍋內，同時加入按配方稱好的各種成分，繼續加熱并攪拌至全部溶化后，停止加熱，補足水分。將培養液分裝入三角瓶中，500 mL錐形瓶內裝150 mL培養液，每瓶加10個玻璃珠，然后用12層紗布外加一層牛皮紙封口。

將三角瓶放入滅菌鍋，上面蓋上報紙，排氣后，待溫度升至121℃開始計時，維持30 min。降壓排氣后，打開鍋蓋冷卻到30℃以下時取出三角瓶放在超凈工作臺中冷卻。

3.3 接種與培養

選取新培養好的試管斜面菌種1支，在無菌條件下每瓶液體培養基接入2 cm2～3 cm2的母種1塊，每支母種可接5個搖瓶。接種好的菌種瓶可置于搖床上培養，也可置于22℃恒溫下靜置培養出48 h后，在確保無雜菌且氣生菌絲延伸到培養液中時再放在搖床上進行培養。搖床頻率為180 r·min-1，培養溫度22℃，一般培養7 d～8 d，見圖7。

圖7 楊樹口蘑液體菌種Fig.7 Liquid strain of Tricheloma popalnum

如圖7所示，a為培養中的液體菌種，b為結束培養的液體菌種。當菌絲球均勻地布滿透明的橙黃色營養液中時停止培養。

4 栽培袋制作與接種

4.1 栽培袋配方

配方1：楊樹木屑78%、麩皮20%、糖1%、石膏 1%，pH 6.5～7.0，含水量 60%～65%。

配方2：楊樹葉78%、麩皮20%、糖1%、石膏1%，pH 6.5～7.0，含水量60%～65%。

4.2 裝袋、滅菌

選17 cm×33 cm×0.005 cm聚丙烯塑料袋，裝袋后袋中間用直徑2 cm木棍打孔到袋底，然后加雙套環。采用高壓滅菌126℃持續1 h。

4.3 接菌與培養。

在無菌條件下，每個栽培袋接入液體菌種50 mL，放入培養室，22℃條件下弱光培養。接種后菌絲生長過程見圖8。

如圖8所示，當基質內布滿菌絲，菌絲具有楊樹菇特有的香味，即可結束培養。在培養過程中，配方1由于楊樹木屑透氣性差，菌絲生長較慢，而配方2透氣好，菌絲生長速度快。一般情況下楊樹木屑培養基長滿需要35 d～40 d，楊樹葉培養基25 d～30 d即可長滿。為提高栽培袋中菌絲生長速度，也可采用窩口方式制作栽培袋，見圖9。

圖8 栽培袋菌絲生長過程Fig.8 Mycelial growth process of cultivation bag

圖9 窩口法制作栽培袋Fig.9 Making cultivation bags by nest-mouth method

如圖9所示，具體方式為裝制菌包時，裝袋機在菌包袋的中間留孔，將菌包培養料上面的塑料袋塞入菌包中間的孔中，然后將周轉棒插入中間的孔中，倒置于筐中準備滅菌。這種方式可以使液體菌種直接接入袋內，菌絲從菌袋中部萌發并向四周輻射生長，可以縮短菌袋培養周期。

5 室內覆土栽培

將培養好的菌袋脫袋后，放入菌種筐內，并將菌種脫袋、裝筐、壓實、覆土，詳見圖10。

圖10 覆土過程Fig.10 Process of soil covering

如圖10所示，為了增加透氣性，菌種筐底部放2層報紙或遮陽網。采用楊樹林的土為覆土原料，暴曬2 d后，加入稻殼5%、石灰2%、過磷酸鈣1%，并噴水使土含水量達到20%（即手握成團、落地即散、手掰土粒不見白為好）。將調好水的土壤均勻地撒在料面上，覆土厚度為3 cm，進行出菇管理。使溫室保持在20℃，空氣相對濕度保持在60%～70%，保持室內空氣新鮮。菌絲生長情況見圖11。

圖11 菌絲長出土面Fig.11 The hyphae grow out of the earth

如圖11所示，菌絲5 d～7 d可長出土層表面，為了保持料面濕度，在土層表面覆蓋一層楊樹葉，保濕效果較好。之后進行催菇管理，加大溫差，使溫度保持在15℃～22℃，早晚溫差達到7℃～8℃，濕度保持在80%～90%，菌絲生長情況見圖12。

如圖12所示，一般菌絲長至土層表面后10 d～15 d可見菌絲扭結、變粗，約20 d～25 d菌絲扭結形成子實體原基形狀。

圖12 出菇管理過程中菌絲生長情況Fig.12 Mycelium growth during fruiting management

6 楊樹林返生栽培試驗

選擇地形平整、正在生長的楊樹林，于8月初在楊樹根部挖30 cm深穴，將生長好的楊樹口蘑菌種運到楊樹林，脫袋后將菌種放穴內，踩實掩埋，并少量淋水，見圖13（圖片由趙英同提供）。

圖13 楊樹林栽培試驗Fig.13 Cultivation experiment in Populus L.forest

如圖13所示，在出菇管理上主要參照野外環境進行出菇管理，在管理中雖能少量出菇，但受自然條件影響太大，效果并不理想。

7 結論

進行了楊樹口蘑采集、菌種分離和馴化研究，主要進行了室內栽培實驗。在室內栽培過程中，采用楊樹葉、楊樹木屑為基本原料進行栽培袋的制作；采用楊樹林的土壤和楊樹葉為覆蓋材料，進行覆土栽培，并進行出菇管理，菌絲爬土后能扭結變粗，形成類似子實體原基的形狀。雖然未形成子實體，但為子實體形成提供了有益探索。將來計劃用楊樹葉、楊樹木屑、楊樹林土壤為主要基質，采用發酵料和熟料等多種方式，以楊樹林的土為主要覆土原料進行進一步的馴化栽培試驗，爭取在楊樹口蘑馴化中有重大突破。