響應(yīng)面法優(yōu)化酶提取柿子多糖工藝研究

王 輝，句榮輝，王 麗，朱建晨

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442）

0 引言

柿果色澤鮮艷、味甜多汁，含有豐富的糖、維C、胡蘿卜素及多種礦物質(zhì)和生物活性成分，具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值[1]。近年來，關(guān)于活性多糖的研究已經(jīng)成為繼基因組學(xué)、酶學(xué)之后的又一個研究熱點(diǎn)[2]。酶法提取是近年來發(fā)展較快的新型提取方法，具有高效性、提取時間短、能耗低等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然化合物及生物活性成分等提取中[3-4]，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降低血糖血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護(hù)肝臟等保健作用[4]。開發(fā)提取柿子中多糖資源，具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多糖是一類大分子化合物，主要由單糖或其衍生物通過聚合形成，是具有生命的生物體機(jī)體活動所必需的有機(jī)物質(zhì)，并起著維持生物體各項(xiàng)機(jī)能運(yùn)轉(zhuǎn)的作用[5]。目前在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)有300 多種天然多糖，其更多的藥理活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，科學(xué)試驗(yàn)研究表明，多糖具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞等功能，同時也是新型健康食品的優(yōu)良功能營養(yǎng)基料[6-7]。20 世紀(jì)初期，科研人員就開始研究各種生物多糖的化學(xué)機(jī)構(gòu)、理化性質(zhì)、功能作用，再到活性分析，成為了近期的研究熱點(diǎn)[8-10]。

酶的專一高效特點(diǎn)使其成為目前研究熱點(diǎn)，酶法提取多糖，也在眾多材料中應(yīng)用廣泛。常見的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、復(fù)合酶等，酶處理法條件較柔和、健康環(huán)保、效率較高，但是酶制劑生產(chǎn)技術(shù)高，使用成本較高[11]。酶提取過程中有溫度、pH 值、時間、酶的種類及添加量等條件因素對提取率有較大影響。酶法提取柿子多糖節(jié)能、省時，與水提法相比提高了多糖得率[12-14]。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

選自房山區(qū)張坊鎮(zhèn)磨盤柿，采后脫水干燥至恒質(zhì)量后粉碎，過0.25 mm 篩篩選，置于干燥器中密封保存?zhèn)溆谩８芍品椒〞煌潭鹊匾鸲嗵墙Y(jié)構(gòu)和及生物活性的改變，但是對多糖提取率和抗氧化活性影響都較小[15-16]。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶、纖維素酶、酸性蛋白酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、濃硫酸、無水葡萄糖、苯酚，均為分析純化學(xué)試劑。

1.1.3 儀器

FA1104N 型萬分之一天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；HC-3018 型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；QL-866 型旋渦振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；T6 型紫外可見分光光度計(jì)，新世紀(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DHG-9053A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；YB-250 型高速多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前處理

稱取2 g 柿子粉→料液比→加酶→混勻1 min→酶解→96 ℃下滅酶15 min→以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min→取上清液。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的葡萄糖工作液于具塞試管中，補(bǔ)水至1.0 mL，加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL 硫酸，靜置10 min，用漩渦振蕩器混勻，置于30 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于波長490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為：Y=0.008 3X-0.026 3。

1.2.3 硫酸苯酚法測定多糖含量

吸取稀釋后的溶液1.0 mL，加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min，用漩渦振蕩器混勻，置于30 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于波長490 nm 處測定吸光度。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以采用單因素試驗(yàn)研究酶、酶添加量、料液比、酶解溫度及酶解時間對柿子多糖提取效果的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對柿子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過擬合二次多項(xiàng)式方程，計(jì)算出最優(yōu)工藝組合和在此條件下柿子多糖得率的最大理論值。

根據(jù)Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，酶添加量（X1）、料液比（X2）、酶解溫度（X3）、酶解時間（X4）為自變量，以+1、0、-1 分別代表自變量的高、中、低水平，以柿子多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。

響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 計(jì)算公式

式中：m1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含糖量，μg；

V1——樣品定容體積，mL；

V2——比色測定時所移取樣品測定液體積，mL；

m2——樣品質(zhì)量，g；

0.9——葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 不同單酶對多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調(diào)pH 值→加入不同的酶15%（分別加纖維素酶、胰蛋白酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶）→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

不同單酶對柿子多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同單酶對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖1 可知，木瓜蛋白酶提取柿子多糖得率最高。由此可見，最佳的酶種類為木瓜蛋白酶。

2.1.2 酶添加量對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調(diào)pH 值為7→不同酶添加量（0，10%，15%，20%，25%）加入酶→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

不同酶添加量對柿子多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同酶添加量對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖2 可知，隨著酶添加量的不斷增加，柿子多糖得率不斷增加，酶添加量為30%時，多糖得率最高。加酶后的得率比不加酶的得率高。

2.1.3 料液比對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→調(diào)pH 值為7→分別配制不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）→加入15%酶→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

圖3 料液比對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖3 可知，在料液比為1∶20 時，多糖得率達(dá)到最高值，當(dāng)料液比超過1∶20時，多糖得率增幅不明顯。可見繼續(xù)增加料液比對進(jìn)一步提高多糖得率的意義不大，所以最佳料液比選擇1∶20。

2.1.4 酶解溫度對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調(diào)pH 值為7→加入酶15%→在（40，45，50，55，60 ℃）下水浴酶解4 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

酶解溫度對柿子多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖4 可知，在提取過程中，在一定時間內(nèi)提取的時間越長，多糖溶解于熱水中就越充分，原因可能為在高溫環(huán)境中，隨時間延長多糖穩(wěn)定性逐漸降低，導(dǎo)致一部分多糖降解，同時熱作用加大了柿子細(xì)胞壁的破壞，使細(xì)胞內(nèi)的多糖容易浸出，但在溫度為50 ℃時，多糖得率達(dá)到最高值。因此，酶解溫度為50 ℃左右。

2.1.5 酶解時間對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調(diào)pH 值為7→加入15%酶→在45 ℃下水浴酶解（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

酶解時間對柿子多糖得率的影響見圖5。

2.3 兩組患者手術(shù)中、手術(shù)后并發(fā)癥比較 觀察組和對照組手術(shù)均順利完成，手術(shù)中及手術(shù)后無并發(fā)癥發(fā)生，均無中轉(zhuǎn)開腹，兩組手術(shù)中、手術(shù)后并發(fā)癥差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 酶解時間對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖5 可知，在酶解時間2.5 h時，多糖得率到達(dá)最高值，之后多糖得率開始下降。可能是柿子多糖提取液在酸性條件下時間的延長產(chǎn)生降解，適當(dāng)延長提取時間，有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放，因此以2.5 h 左右為參考值。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，多糖得率回歸方程模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 多糖得率回歸方程模型方差分析

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面分析法可以幫助建立一個或多個測定指標(biāo)與關(guān)鍵影響因素之間的關(guān)系模型，并可以進(jìn)行定量分析。從方差分析表3 可知，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得模型的F 值為2.11，p 值為0.087 7，表示該模型不顯著。利用軟件對表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合，建立多糖得率回歸模型，獲得評價(jià)指標(biāo)響應(yīng)值對自變量X1X2X3X4二次多項(xiàng)式回歸方程：

多糖得率=40.41-0.16X1+5.52X2-0.19X3-0.085X4-3.90X1X2-3.49X1X3-0.78X1X4+16.68X2X3-1.66X2X4+1.31X3X4-2.45X12+4.26X22+1.22X32-6.61X42.

由此可知，各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系并不是簡單的線性關(guān)系。方程的失擬度F 值為13.36，表示相對于絕對誤差而言，失擬度顯著，說明該回歸方程未能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。模型的校正系數(shù)R2=0.678 2，說明該模型能解釋67.82%響應(yīng)值的變化。在所選取各因素水平范圍內(nèi)，由F 值的大小可以知道，影響因素主次順序?yàn)槊附鉁囟龋╔3）＞料液比（X2）＞酶解時間（X4）＞酶添加量（X1）。交互作用主次順序?yàn)閄2X3＞X1X2＞X1X3＞X2X4＞X3X4＞X1X4。

2.4 試驗(yàn)因素交互作用對響應(yīng)值影響的分析

酶添加量與料液比交互作用見圖6，酶添加量與酶解溫度交互作用見圖7，酶添加量與酶解時間交互作用見圖8。

圖7 酶添加量與酶解溫度交互作用

響應(yīng)面圖可以較為直觀地看出任意2 個交互項(xiàng)對柿子多糖得率的影響規(guī)律。各圖顯示酶添加量、料液比、酶解溫度和酶解時間中任意2 個變量編碼為零水平時，其余2 個變量對多糖得率的影響。

由圖6～圖11 曲面圖可知其坡度較緩，說明兩者大交互作用不太顯著，圖6～圖8 可知酶添加量與料液比、酶解溫度、酶解時間之間的交互作用，料液比在剛開始增加時，多糖得率也隨之增大，隨著酶解溫度的提高多糖得率也在增大。酶解時間和酶添加量之間有個最高值，可能是過長的酶解時間會使溶出的多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，而加酶的多少并沒有很好地提高多糖得率，從而使多糖得率下降。

圖8 酶添加量與酶解時間交互作用

料液比與酶解溫度交互作用見圖9，料液比與酶解時間交互作用見圖10，酶解溫度與酶解時間交互作用見圖11。

圖9 料液比與酶解溫度交互作用

圖10 料液比與酶解時間交互作用

由圖9～圖11 可知，料液比與酶解溫度、酶解時間之間的交互作用，在試驗(yàn)中未能得出其最高值，通過料液比的不同，酶作用時間延長，酶的活力會相對下降，溫度的升高為酶促反應(yīng)提供了能量，可以增加多糖得率。由圖11 可知，酶解溫度與酶解時間之間的交互作用，隨著溫度和時間的遞增，多糖得率也隨之增加。

圖11 酶解溫度與酶解時間交互作用

3 結(jié)論

研究了柿子多糖的提取工藝，采用傳統(tǒng)的水提法獲得的磨盤柿多糖得率僅為57.21%，在此工藝條件下，柿子多糖得率為81.29%。酶法借助了酶的作用加快細(xì)胞壁組分水解并破壞其結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖等活性成分的釋放，提高得率。得出柿子多糖的最佳提取工藝條件為酶添加量25%，料液比1∶20，酶解溫度55 ℃，酶解時間2.5 h，此條件下得到的實(shí)際多糖提取率為81.29%，較水提法提高了42.09%。通過和其他試驗(yàn)結(jié)果對比其結(jié)果具有一定的可靠性，該法提取柿子多糖含量高、快速、穩(wěn)定，合理可行，優(yōu)化的工藝條件可用于柿子多糖的提取。

北京市房山區(qū)擁有有極為豐富的柿子資源，對于其中多糖的研究開發(fā)利用有著得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢。目前，我國對天然產(chǎn)物多糖提取及相關(guān)生物活性已有了一定程度的研究。但總體來說，對于柿子多糖的提取方法研究還不是很多；柿子多糖的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)與其生物活性之間存在怎樣關(guān)系的研究也較少。因此，應(yīng)廣泛參考國內(nèi)外其他天然產(chǎn)物多糖提取的方法，總結(jié)出相對合理的經(jīng)驗(yàn)，在柿子多糖提取中融入現(xiàn)代新的提取技術(shù)，創(chuàng)新升級，從而提高柿子多糖得率。通過研究柿子多糖生物活性及其作用機(jī)制，了解多糖的生物活性與人體健康之間的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)柿子多糖的功能化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)提供理論研究依據(jù)。