響應面法優化酶提取柿子多糖工藝研究

王 輝，句榮輝，王 麗，朱建晨

（北京農業職業學院，北京 102442）

0 引言

柿果色澤鮮艷、味甜多汁，含有豐富的糖、維C、胡蘿卜素及多種礦物質和生物活性成分，具有較高的營養和藥用價值[1]。近年來，關于活性多糖的研究已經成為繼基因組學、酶學之后的又一個研究熱點[2]。酶法提取是近年來發展較快的新型提取方法，具有高效性、提取時間短、能耗低等特點，已經廣泛應用于天然化合物及生物活性成分等提取中[3-4]，多糖具有免疫調節、抗腫瘤、降低血糖血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護肝臟等保健作用[4]。開發提取柿子中多糖資源，具有極其重要的現實意義。

多糖是一類大分子化合物，主要由單糖或其衍生物通過聚合形成，是具有生命的生物體機體活動所必需的有機物質，并起著維持生物體各項機能運轉的作用[5]。目前在世界范圍內發現有300 多種天然多糖，其更多的藥理活性逐漸被發現，科學試驗研究表明，多糖具有抗氧化、抗病毒、調節免疫、抗疲勞等功能，同時也是新型健康食品的優良功能營養基料[6-7]。20 世紀初期，科研人員就開始研究各種生物多糖的化學機構、理化性質、功能作用，再到活性分析，成為了近期的研究熱點[8-10]。

酶的專一高效特點使其成為目前研究熱點，酶法提取多糖，也在眾多材料中應用廣泛。常見的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、復合酶等，酶處理法條件較柔和、健康環保、效率較高，但是酶制劑生產技術高，使用成本較高[11]。酶提取過程中有溫度、pH 值、時間、酶的種類及添加量等條件因素對提取率有較大影響。酶法提取柿子多糖節能、省時，與水提法相比提高了多糖得率[12-14]。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

選自房山區張坊鎮磨盤柿，采后脫水干燥至恒質量后粉碎，過0.25 mm 篩篩選，置于干燥器中密封保存備用。干制方法會不同程度地引起多糖結構和及生物活性的改變，但是對多糖提取率和抗氧化活性影響都較小[15-16]。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶、纖維素酶、酸性蛋白酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、濃硫酸、無水葡萄糖、苯酚，均為分析純化學試劑。

1.1.3 儀器

FA1104N 型萬分之一天平，上海菁海儀器有限公司產品；HC-3018 型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；QL-866 型旋渦振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品；T6 型紫外可見分光光度計，新世紀北京普析通用儀器有限責任公司產品；DHG-9053A 型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司產品；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產品；YB-250 型高速多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理

稱取2 g 柿子粉→料液比→加酶→混勻1 min→酶解→96 ℃下滅酶15 min→以轉速4 000 r/min 離心10 min→取上清液。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制作

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的葡萄糖工作液于具塞試管中，補水至1.0 mL，加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL 硫酸，靜置10 min，用漩渦振蕩器混勻，置于30 ℃水浴中反應10 min，于波長490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作葡萄糖標準曲線。得到回歸方程為：Y=0.008 3X-0.026 3。

1.2.3 硫酸苯酚法測定多糖含量

吸取稀釋后的溶液1.0 mL，加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min，用漩渦振蕩器混勻，置于30 ℃水浴中反應10 min，于波長490 nm 處測定吸光度。

1.2.4 試驗設計

單因素試驗設計：以采用單因素試驗研究酶、酶添加量、料液比、酶解溫度及酶解時間對柿子多糖提取效果的影響。

響應面試驗設計在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法對柿子多糖的提取工藝進行優化，通過擬合二次多項式方程，計算出最優工藝組合和在此條件下柿子多糖得率的最大理論值。

根據Box-behnken 試驗設計原理，依據單因素試驗結果，酶添加量（X1）、料液比（X2）、酶解溫度（X3）、酶解時間（X4）為自變量，以+1、0、-1 分別代表自變量的高、中、低水平，以柿子多糖得率為指標，進行響應曲面分析。

響應面因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素與水平設計

1.2.5 計算公式

式中：m1——從標準曲線上查得樣品測定液中含糖量，μg；

V1——樣品定容體積，mL；

V2——比色測定時所移取樣品測定液體積，mL；

m2——樣品質量，g；

0.9——葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 不同單酶對多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調pH 值→加入不同的酶15%（分別加纖維素酶、胰蛋白酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶）→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

不同單酶對柿子多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同單酶對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖1 可知，木瓜蛋白酶提取柿子多糖得率最高。由此可見，最佳的酶種類為木瓜蛋白酶。

2.1.2 酶添加量對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調pH 值為7→不同酶添加量（0，10%，15%，20%，25%）加入酶→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

不同酶添加量對柿子多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同酶添加量對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖2 可知，隨著酶添加量的不斷增加，柿子多糖得率不斷增加，酶添加量為30%時，多糖得率最高。加酶后的得率比不加酶的得率高。

2.1.3 料液比對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→調pH 值為7→分別配制不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）→加入15%酶→45 ℃下水浴酶解2 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

圖3 料液比對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖3 可知，在料液比為1∶20 時，多糖得率達到最高值，當料液比超過1∶20時，多糖得率增幅不明顯?？梢娎^續增加料液比對進一步提高多糖得率的意義不大，所以最佳料液比選擇1∶20。

2.1.4 酶解溫度對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調pH 值為7→加入酶15%→在（40，45，50，55，60 ℃）下水浴酶解4 h→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

酶解溫度對柿子多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖4 可知，在提取過程中，在一定時間內提取的時間越長，多糖溶解于熱水中就越充分，原因可能為在高溫環境中，隨時間延長多糖穩定性逐漸降低，導致一部分多糖降解，同時熱作用加大了柿子細胞壁的破壞，使細胞內的多糖容易浸出，但在溫度為50 ℃時，多糖得率達到最高值。因此，酶解溫度為50 ℃左右。

2.1.5 酶解時間對柿子多糖得率的影響

稱取2 g 柿子粉→料液比1∶20→調pH 值為7→加入15%酶→在45 ℃下水浴酶解（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）→95 ℃下滅酶10 min→離心去渣→取上清液測定多糖得率。

酶解時間對柿子多糖得率的影響見圖5。

2.3 兩組患者手術中、手術后并發癥比較 觀察組和對照組手術均順利完成，手術中及手術后無并發癥發生，均無中轉開腹，兩組手術中、手術后并發癥差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 酶解時間對柿子多糖得率的影響

在固定條件下，由圖5 可知，在酶解時間2.5 h時，多糖得率到達最高值，之后多糖得率開始下降?？赡苁鞘磷佣嗵翘崛∫涸谒嵝詶l件下時間的延長產生降解，適當延長提取時間，有利于細胞內有效成分的釋放，因此以2.5 h 左右為參考值。

2.2 響應面優化試驗

響應面試驗設計與結果見表2，多糖得率回歸方程模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 多糖得率回歸方程模型方差分析

2.3 響應面試驗結果及方差分析

響應面分析法可以幫助建立一個或多個測定指標與關鍵影響因素之間的關系模型，并可以進行定量分析。從方差分析表3 可知，由試驗數據所得模型的F 值為2.11，p 值為0.087 7，表示該模型不顯著。利用軟件對表2 中試驗數據進行二次線性回歸擬合，建立多糖得率回歸模型，獲得評價指標響應值對自變量X1X2X3X4二次多項式回歸方程：

多糖得率=40.41-0.16X1+5.52X2-0.19X3-0.085X4-3.90X1X2-3.49X1X3-0.78X1X4+16.68X2X3-1.66X2X4+1.31X3X4-2.45X12+4.26X22+1.22X32-6.61X42.

由此可知，各影響因素與響應值的關系并不是簡單的線性關系。方程的失擬度F 值為13.36，表示相對于絕對誤差而言，失擬度顯著，說明該回歸方程未能較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。模型的校正系數R2=0.678 2，說明該模型能解釋67.82%響應值的變化。在所選取各因素水平范圍內，由F 值的大小可以知道，影響因素主次順序為酶解溫度（X3）＞料液比（X2）＞酶解時間（X4）＞酶添加量（X1）。交互作用主次順序為X2X3＞X1X2＞X1X3＞X2X4＞X3X4＞X1X4。

2.4 試驗因素交互作用對響應值影響的分析

酶添加量與料液比交互作用見圖6，酶添加量與酶解溫度交互作用見圖7，酶添加量與酶解時間交互作用見圖8。

圖7 酶添加量與酶解溫度交互作用

響應面圖可以較為直觀地看出任意2 個交互項對柿子多糖得率的影響規律。各圖顯示酶添加量、料液比、酶解溫度和酶解時間中任意2 個變量編碼為零水平時，其余2 個變量對多糖得率的影響。

由圖6～圖11 曲面圖可知其坡度較緩，說明兩者大交互作用不太顯著，圖6～圖8 可知酶添加量與料液比、酶解溫度、酶解時間之間的交互作用，料液比在剛開始增加時，多糖得率也隨之增大，隨著酶解溫度的提高多糖得率也在增大。酶解時間和酶添加量之間有個最高值，可能是過長的酶解時間會使溶出的多糖結構遭到破壞，而加酶的多少并沒有很好地提高多糖得率，從而使多糖得率下降。

圖8 酶添加量與酶解時間交互作用

料液比與酶解溫度交互作用見圖9，料液比與酶解時間交互作用見圖10，酶解溫度與酶解時間交互作用見圖11。

圖9 料液比與酶解溫度交互作用

圖10 料液比與酶解時間交互作用

由圖9～圖11 可知，料液比與酶解溫度、酶解時間之間的交互作用，在試驗中未能得出其最高值，通過料液比的不同，酶作用時間延長，酶的活力會相對下降，溫度的升高為酶促反應提供了能量，可以增加多糖得率。由圖11 可知，酶解溫度與酶解時間之間的交互作用，隨著溫度和時間的遞增，多糖得率也隨之增加。

圖11 酶解溫度與酶解時間交互作用

3 結論

研究了柿子多糖的提取工藝，采用傳統的水提法獲得的磨盤柿多糖得率僅為57.21%，在此工藝條件下，柿子多糖得率為81.29%。酶法借助了酶的作用加快細胞壁組分水解并破壞其結構，促進多糖等活性成分的釋放，提高得率。得出柿子多糖的最佳提取工藝條件為酶添加量25%，料液比1∶20，酶解溫度55 ℃，酶解時間2.5 h，此條件下得到的實際多糖提取率為81.29%，較水提法提高了42.09%。通過和其他試驗結果對比其結果具有一定的可靠性，該法提取柿子多糖含量高、快速、穩定，合理可行，優化的工藝條件可用于柿子多糖的提取。

北京市房山區擁有有極為豐富的柿子資源，對于其中多糖的研究開發利用有著得天獨厚的資源優勢。目前，我國對天然產物多糖提取及相關生物活性已有了一定程度的研究。但總體來說，對于柿子多糖的提取方法研究還不是很多；柿子多糖的化學組成結構與其生物活性之間存在怎樣關系的研究也較少。因此，應廣泛參考國內外其他天然產物多糖提取的方法，總結出相對合理的經驗，在柿子多糖提取中融入現代新的提取技術，創新升級，從而提高柿子多糖得率。通過研究柿子多糖生物活性及其作用機制，了解多糖的生物活性與人體健康之間的關系，為實現柿子多糖的功能化、產業化、規模化生產提供理論研究依據。