蘋果腐敗菌的分離與鑒定

季春艷，段夢晴，曾雅倩，獨夢蕊，劉生杰，2， 劉艷紅

（1.阜陽師范大學 信息工程學院，安徽 阜陽 236037；2.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037）

蘋果中含有豐富的營養物質，因其營養價值高為人們所喜愛，但富含營養也為腐敗微生物滋生提供了良好條件，為蘋果的貯藏保鮮帶來難度[1]。影響蘋果腐敗變質的因素有很多，有物理因素、化學因素、生物因素等，其中微生物感染是導致蘋果腐敗變質的重要原因。只要環境適宜，病原菌侵染蘋果后生長繁殖，分解吸收利用果實中的營養物質，來滿足自身生長代謝的需要，蘋果的營養成分被破壞，果實腐敗并產生不良氣味，失去了原有的感官品質和營養價值[2-3]。蘋果的常見微生物侵染型病害有霉心病、輪紋病、青霉病等[4]。引起這些病害的主要微生物為青霉（Penicillium sp.）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）等，都是從碰、壓、磕、刺傷或病蟲害的部位侵入果實，引起蘋果發病。蘋果腐敗變質嚴重阻礙了我國蘋果產業的發展。

以市售常見紅富士腐爛蘋果為原料，對爛蘋果上的微生物進行了分離，通過侵染試驗驗證分離菌株的致腐能力，并對該微生物進行鑒定，以期為深入研究致腐微生物對蘋果的致病機理和保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售自然腐爛紅富士蘋果。

1.2 儀器設備

BPC-250F 型生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司產品；T100P 型PCR 儀，上海興曼生物科技有限公司產品；BM1000 型光學顯微鏡，德國Eppendof 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離可能的致病菌

挑選腐敗的紅富士蘋果，切除蘋果表面腐敗組織作為樣品，將25 g 果肉樣品加入225 mL 滅菌水中，均質，按照10 倍系列稀釋[5]。選擇適當的稀釋液，取1 mL 的稀釋液涂抹在PDA 培養基上。培養1～2 d，再用平板劃線方法分離純化，連續純化5～6 次，直至長出單個菌，將純化的菌種置于4 ℃下保存[6-8]。

1.3.2 致腐能力測定

（1）孢子懸浮液制備。將已分離菌接種到PDA培養基上，在28 ℃下培養約5 d，挑取菌落孢子于無菌水中，用血球板計數，孢子懸浮液的質量濃度配制為1×105CFU/mL。

（2）接種。蘋果→清洗→消毒（200 mg/L 次氯酸鈉浸泡10 min）→70 %酒精噴涂蘋果表面→晾干→在蘋果果實的赤道部位用滅菌不銹鋼鐵釘（約4 mm）形成統一大小的創傷口。每個蘋果隨機選擇3 個創口接種20 μL 孢子懸浮液，另一個創口接種等量的無菌水作為對照試驗。

（3）菌斑直徑的測量。接種后的蘋果放置在28 ℃環境下培養，并每天觀察和測量病斑直徑，若蘋果病斑直徑大于2 mm 為腐敗菌，反之不是腐敗菌。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）形態觀察。挑取純培養菌落，于光學顯微鏡下觀察菌株形態特征，進行初步鑒定。

（2）微生物基因組DNA 提取與電泳檢測。采用CTAB 方法提取基因組DNA，主要參照易慶平，馮廣達等人[9-10]的方法，配制質量分數為0.7%的凝膠，電泳檢測基因組DNA。根據電泳檢測結果判斷該菌基因組序列大小[3，11]。

（3）真菌ITS 序列測定與分析。將提取出來的DNA 產物送往北京睿博興科生物技術有限公司測序，采用ITS 序列擴增通用引物ITS4，ITS5 進行PCR 擴增，從而鑒定分離純化的菌的ITS 序列，將測得的序列通過BLAST 軟件進行比對，并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 分離可能的致病菌

注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況見圖1。

圖1 注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況

2.2 致腐能力測定

注射孢子懸浮液后的病斑直徑見圖2。

圖2 注射孢子懸浮液后的病斑直徑

圖1 是在同一個蘋果上用滅菌不銹鋼鐵釘（約4 mm）形成統一大小的創傷口，4 個創傷口，如圖1（a）（b）（c）（d），分別命名為孔1，2，3，4，其中孔1～3（a～c）是試驗組，3 個孔分別接種質量濃度為1×105CFU/mL 的該菌孢子懸浮液20 μL 于28 ℃培養5 d，圖1（d）為對照組，即接種等量的無菌水。圖2 為接種后1～5 d 菌斑直徑的測定結果。從圖1 和圖2 可以看出，該菌可以使健康蘋果腐敗，且病斑直徑隨著接種時間延長不斷生長，根據科赫法則原理，可以確定分離出的菌株能夠使蘋果腐敗。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態觀察

對純化后的菌進行形態學觀察見圖3。

圖3 對純化后的菌進行形態學觀察

從蘋果表面提取病料，接種至PDA 培養基，經分離純化發現培養基上長出單個菌落，菌落較大、疏松、干燥，呈絨毛狀，灰白色，可沿培養基表面蔓延生長（圖3（a））。挑取單菌落邊緣部分于載玻片上的無菌水中，在光學顯微鏡下（油鏡下，10×100 倍）觀察，可以看出有纖細管狀的疑似菌絲的結構（圖3（b）），從形態觀察推測該菌株是真菌。

2.3.2 ITS 序列擴增及電泳

基因組DNA 電泳的檢測結果見圖4。

從純化后的菌株中提取了7 管基因組DNA，編號為1～7，分別以7 管中的DNA 為模板，以真菌ITS 通用引物進行PCR 擴增，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從圖4 中可以看出，1，2，4，5 這4 個管中序列DNA 條帶明顯，且DNA 序列大小在500 bp左右，這與真菌的ITS 序列片段長度一般在500～750 bp 相吻合，所以可以初步判斷該菌株為真菌。

圖4 基因組DNA 電泳的檢測結果

2.3.3 真菌ITS 序列測定與分析

將提取出來的DNA 產物進行基因序列的測定，得到真菌的基因ITS 序列。

真菌ITS 測定序列見圖5。

圖5 真菌ITS 測定序列

將測得的序列通過BLAST 軟件進行比對[12-17]，比對結果顯示，菌株（命名為XXGC-1）與色二孢屬基因序列的同源性高達99.34%，將測得的序列通過BLAST 軟件與已知微生物比對構建系統發育樹，在系統發育樹中XXGC-1 與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）等菌能聚在一起（圖6），表明菌株是色二孢屬中一種。

基于ITS 序列構建的系統發育樹見圖6。

圖6 基于ITS 序列構建的系統發育樹

3 結論

對腐爛蘋果上腐敗菌分離、鑒定。通過平板分離純化、蘋果菌落特征觀察、光學顯微鏡觀察、ITS序列測定，及系統發育樹構建，結果表明該菌種與色二孢屬（Diplodia seriata）有99.34%的相似率，且與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）親緣關系最近。通過侵染試驗表明，該菌種具有致腐能力。致腐試驗結果與原腐敗現象基本一致、癥狀表現基本相同。

目前，從腐敗蘋果中分離并鑒定出的微生物主要有細菌和真菌，細菌有歐文氏菌（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、棒桿菌屬（Corynebacteriurn）、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬等，真菌有青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢屬（Cladosporium）等，色二孢屬在果蔬種植過程中較常見，如它能夠引起葡萄藤頂端枯萎、藤蔓變白、芽體壞死及嫁接失敗等癥狀。而對于色二孢屬對蘋果果實的致腐問題鮮有研究。

一般腐敗霉菌侵入果蔬組織先附著在果蔬表面，孢子萌發產生芽管能夠識別合適的滲透位置，然后形成附著胞和侵染墊等侵染結構，在侵染結構形成期間，逐漸代謝產生纖維素酶和果膠酶等細胞壁降解酶，腐敗霉菌的主要致病因子是細胞壁降解酶和毒素，有的腐敗菌也會增加蘋果中促使果蔬發生褐變的關鍵酶的活性，如PPO 和POD 等，從而加速果實的褐變反應；有的腐敗菌能夠改變果蔬的風味物質，加快風味物質的代謝和揮發，改變與軟化相關的關鍵酶的活性，如PG、PME、CX 酶等[3]。所以，推測試驗分離的腐敗菌可能有以上致病機理。試驗存在一些不足之處，只對蘋果上的腐敗菌進行分離鑒定，且只分離鑒定出一種菌，未能分離出多種菌株，也無法解釋該菌的致病機理，在此試驗的基礎上可以從以下幾個方面進行深入研究：

（1）該菌種導致蘋果腐敗機理尚不清楚，還需要進一步檢測相關指標，如壞果率、抗壞血酸含量、丙二醛含量、過氧化氫酶活性等，同時也可進一步檢測相關抗性基因表達情況，從而進一步探尋該菌對蘋果果實的致腐機理及蘋果果實的應答機制。

（2）尋找能夠抑制蘋果中的色二孢屬（Diplodia seriata）的方法，并通過感官評價和相關指標的測定證明該方法安全有效。

（3）在腐爛的蘋果上再分離純化多個菌種，并探尋它們的致病制腐機理，也可從其他腐爛水果上分離鑒定菌種，并探尋其致病或致腐機理。

（4）探尋蘋果保鮮方法，找到抑制有害微生物生長繁殖的安全可行的方法。但是，由于其中的微生物種類多，影響因素繁多，環境條件也變化多端，存在許多不定的因素，且不同微生物之間也會相互影響。因此，探尋最佳蘋果保鮮效果是需要大量的試驗數據和實踐經驗的，還需進一步深入研究。