高粱轉錄因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境脅迫下的表達分析

杜巧麗 蔣君梅 陳美晴 方遠鵬 李向陽 任明見,2 謝 鑫,*

(1 貴州大學農學院農業微生物特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2 國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025；3 貴州大學綠色農藥與農業生物工程教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

高粱(Sorghumbicolor)屬于禾本科單子葉植物，是一種典型的旱糧經濟作物，具較強的耐鹽堿性、抗旱性、耐高溫等抗逆特性[1]。但近年來，高粱受到病毒[2]、重金屬[3]和真菌[4]等逆境脅迫，以及多種非生物逆境脅迫的影響，如低溫[5]、干旱、高鹽[6]等，嚴重影響高粱的產量和品質。因此，對高粱抗逆境脅迫基因進行研究具有重要意義。

轉錄因子(transcription factor，TF)又稱反式作用因子，在植物次生代謝過程具有重要作用。它也可特異性與基因的啟動子結合，在基因的表達過程中起調控作用，同時還能結合生物體內外的信號因子，進而對外界環境刺激做出應答反應[7-8]。植物轉錄因子主要分為2種，一種為特異性轉錄因子，它們主要通過選擇性調控某些基因的轉錄表達，另一種是非特異性轉錄因子，通過非選擇性調控基因的轉錄表達[9]。轉錄因子廣泛參與植物生長發育的各個環節(如開花[10]、衰老[11]、生長繁殖[12]、非生物脅迫[13]和生物脅迫[14])。WRKY作為植物中一類重要轉錄因子，在植物的整個生長周期中發揮重要作用。研究報道，WRKY轉錄因子含有高度保守的核心氨基酸序列，在C-末端含有一個鋅指結構，可對(T)(T)TGAC(C/T)序列進行特異性識別，同時參與植物的抗病反應[15-16]；WRKY71作為WRKY轉錄因子家族的一員，目前已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[17]、水稻(Oryzasativa)[18]、草莓(Fragariavesca)[19]、芥菜(Brassicajuncea)[20]、玉米(Zeamays)[21]等植物中報道，但鮮見WRKY71基因在高粱中的研究報道。

本試驗從高粱中克隆得到一個SbWRKY71基因，利用生物信息學方法研究其基本特征，并通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)檢測SbWRKY71基因在不同組織、不同激素以及逆境脅迫條件下的相對表達量，了解其在抗逆脅迫中的作用，旨在為SbWRKY71基因的生物學功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 高粱品種及處理方法 本研究所用高粱BTx623品種由貴州大學植物病理教研室保存。高粱種子處理方法及培養條件參照蔣君梅等[22]的方法，使用激素脫落酸(abscisic acid，ABA，200 μmol·L-1)、水楊酸(salicylic acid，SA，1 mmol·L-1)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA，10 μmol·L-1)、氯化鈉(NaCl，250 mmol·L-1)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid，GABA，1 mmol·L-1)、 甘露醇(D-Mannitol，300 mmol·L-1)、鞭毛蛋白(flg22，100 nmol·L-1)、翻譯延長因子(translation elongation factor，elf18，100 nmol·L-1)和幾丁質(Chitin，8 nmol·L-1)進行噴施處理，分別在0、0.5、1、3、6、9、12和24 h進行取樣，設置3個生物學重復，每個重復處理3株苗，將所取樣品立即用液氮進行速凍，置于-80℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑 本研究采用北京康潤誠業生物科技有限公司的RT-qPCR反轉錄試劑盒；ABA、SA、IAA、NaCl、GABA、D-Mannitol試劑均購自北京酷來搏科技有限公司；flg22、elf18和Chitin分別購自南京金斯瑞生物科技有限公司、美國Ezbiolab和圣克魯斯生物技術(上海)有限公司。

1.2 高粱SbWRKY71基因克隆

取處理好的高粱樣品，提取RNA并反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用引物SbWRKY71-F/SbWRKY71-R對SbWRKY71基因進行擴增，PCR產物經純化后插入pEASY-Blunt載體(北京全式金生物技術有限公司)。引物設計和PCR擴增反應體系參照陳美晴等[23]的方法。

1.3 生物信息學分析

獲取其他物種SbWRKY71同源蛋白序列，利用MEGA7.0軟件，以鄰接法(neighbor-joining，NJ；bootstrap=1 000)構建系統發育樹，后經DNAMAN6.0完成序列比對；根據EXPASy[24](https://web.expasy.org/)完成SbWRKY71蛋白理化性質預測；SbWRKY71蛋白的高級結構測定、亞細胞定位等生物信息學分析參照已報道的方法[25]。

1.4 高粱SbWRKY71基因表達分析

以高粱SbEIF4a為內參基因，分別以高粱不同組織以及經不同條件處理后的葉片總cDNA為模板，檢測SbWRKY71基因表達量。擴增引物如表1所示，擴增體系參照已報道的方法[24]。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 高粱SbWRKY71基因的PCR擴增

以高粱BTx623苗期cDNA為模板進行PCR擴增，得到序列大小為1 335 bp的目的基因片段，共編碼364個氨基酸。隨后采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測(圖1)，并進行測序比對，得到的條帶大小與數據庫中的一致。

Note：1：SbWRKY71. M：Marker.

2.2 高粱SbWRKY71蛋白理化性質分析及序列分析

采用Prot-param工具對SbWRKY71蛋白理化性質進行分析(表2)；同時利用Softberry軟件對SbWRKY71蛋白進行亞細胞定位，預測該蛋白定位于細胞核。

表2 SbWRKY71基因編碼蛋白的基本特征

利用DNAMAN6.0將高粱SbWRKY71與其他物種的WRKY71氨基酸序列進行多序列比對及同源性分析，如圖2所示，不同物種間WRKY71相關蛋白的氨基酸序列均存在1個保守的WRKY結構域，整體一致性為63%，即WRKY71在不同植物間相對保守。同時利用MEGA7.0對水稻、短柄草、玉米、高粱、小麥和二穗短柄草等物種的WRKY71蛋白序列進行系統發育進化樹的構建，結果表明，高粱SbWRKY71與禾本科作物玉米ZmWRKY71的親緣關系最近，且為75%(圖3)。

注：黑色框表示WRKY71蛋白保守結構域；Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麥(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)。

注：Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Si：谷子(Setaria italica)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麥(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)；Eg：油棕(Elaeis guineensis)；Gh：棉花(Gossypium hirsutum)；Br：油菜(Brassica rapa)；At：擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Va：葡萄(Vitis amurensis)；Cp：臘梅(Chimonanthus praecox)；Pc：櫻桃(Prunus cerasus)。

2.3 高粱 SbWRKY71蛋白結構預測

利用NPS@在線預測SbWRKY71蛋白二級結構，SbWRKY71蛋白由364個氨基酸組成，其中α-螺旋占32.69%，無規則卷曲占61.54%，無β-折疊。利用SMART在線軟件預測該蛋白保守功能域，SbWRKY71蛋白主要含有2個低復雜區和1個WRKY結構域。通過SWISS-MODEL預測該蛋白的三級結構，發現SbWRKY71蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲構成(圖4)，與NPS@預測的結果一致。

圖4 SbWRKY71蛋白三級結構預測

2.4 高粱SbWRKY71基因順勢作用元件分析

利用PlantCARE對SbWRKY71基因的順勢作用元件進行分析(表3)，結果表明SbWRKY71基因可能參與脫落酸、茉莉酸等信號通路。

表3 SbWRKY71基因啟動子區順勢作用元件預測

2.5 SbWRKY71基因表達分析

2.5.1SbWRKY71基因組織表達特征 為探究SbWRKY71基因的組織表達模式，采用qRT-PCR分析SbWRKY71在高粱根、莖、葉和芽中的表達情況。結果表明，SbWRKY71基因在根、莖、葉和芽不同組織均有表達，并具有組織特異性，其中在葉中的表達最高，其次是根，在莖和芽中表達較少(圖5)。

注：不同小寫字母表示相對表達量具有顯著差異(P<0.05)；內參基因：SbEIF4a。下同。

2.5.2SbWRKY71基因響應激素表達分析 為檢測植物激素是否影響SbWRKY71的表達，分別用SA、ABA和IAA處理高粱，發現在SA處理下，SbWRKY71的表達呈先升后降趨勢(圖6-A)，ABA和IAA處理后，SbWRKY71的表達呈現先下降后升高再下降的趨勢(圖6-A、B、C)，基因表達量均在6 h出現最大值。

2.5.3SbWRKY71基因響應干旱及鹽脅迫表達分析 用GABA、D-Mannitol、NaCl模擬干旱及鹽脅迫，對SbWRKY71基因表達進行分析。結果表明，在GABA(圖6-D)、D-Mannitol(圖6-E)和NaCl(圖6-F)處理下，SbWRKY71基因均受到誘導表達，其表達量分別在3、6和9 h達到最大值。以上結果說明SbWRKY71可能是高粱響應干旱及鹽脅迫的一個功能基因。

2.5.4SbWRKY71基因響應病原相關分子模式(PAMPs)表達分析 為檢測SbWRKY71在PAMPs激發子flg22、elf18和Chitin處理下的表達量變化，分別用flg22、elf18和Chitin模擬高粱生物脅迫下的影響，發現經flg22、elf18處理后，SbWRKY71基因表達量在極短時間內均被顯著抑制，之后表達量幾乎維持在相同水平(圖6-G、I)，但在Chitin處理下，SbWRKY71基因表達量呈現出先升后降的表達模式(圖6-H)。上述結果表明，SbWRKY71基因表達受到flg22和elf18的顯著抑制，而受到Chitin的誘導表達，綜上所述，SbWRKY71在參與植物先天免疫應答過程中具有重要作用。

圖6 SbWRKY71基因表達分析

3 討論

植物在生長過程中可能會遭受各種非生物和生物脅迫，此時植物自身會產生一系列復雜的防御機制(包括生理和代謝過程中的防御反應)，來保護自身免受各種逆境脅迫的危害。這些防御反應過程涉及復雜的信號網絡，并通過大量的轉錄因子和防御反應基因對防御過程進行調節。植物中WRKY轉錄因子是植物中最大的一類轉錄因子，廣泛參與植物的生長發育、防御反應和代謝調控[26]。大量研究表明，WRKY轉錄因子在受到病原菌[如丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、黃單胞菌(Xanthomonasaxonopodis)]侵染后，可能被作為正調控因子，也可能被作為負調控因子[27-28]。在小麥[29]、擬南芥[30-31]和水稻[18]中，WRKY71基因分別在調控植物應對病害抗性、葉發育、花期調控以及非生物脅迫等中具有重要意義。

本研究結果表明，經過激素SA處理后的高粱SbWRKY71基因表達量在較短時間內顯著上調，處理6 h時表達量升高并達到最大值，在12 h又顯著降低，這與在玉米中[21]的研究存在一定相似性，即ZmWRKY71的表達基本呈現先上調后下調的情況，說明在不同物種中WRKY71基因在激素應答過程中存在一定差異；在ABA處理下，SbWRKY71的基因表達量在1 h被顯著抑制，但在6 h又被顯著誘導并達到最大值，而在擬南芥中[17,31]，AtWRKY71在ABA處理下，基因受到誘導表達，從側面暗示WRKY71基因在參與調控植物應對激素應答反應中具有重要作用。此外，該類基因在組織表達上也存在顯著差異，SbWRKY71基因主要表現在葉中表達，在莖中低表達，但在草莓中[19]，FvWRKY71基因主要在果實中表達，并且該基因的表達量隨著果實的成熟表達量顯著升高，而OsWRKY71在孕穗期劍葉中表達量最高[18]，由此可知WRKY71基因的特異表達在不同物種中也存在一定的差異性；在NaCl處理下，SbWRKY71基因表達呈先升后降趨勢，即在9 h達到最大值，大約持續3 h后，又顯著下調；這與芥菜型油菜[20](Brassicajuncea)部分基因在高鹽處理下的研究結果一致，即BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4基因的表達量呈先升后降模式，但BjuWRKY71-3基因在高鹽條件下，其表達量在24 h內一直逐漸升高，同時與擬南芥AtWRKY40同源的基因BnD11在抗旱性品種中報道極為相似[32]；在小麥中[33]，TaWRKY33也能受到NaCl的誘導表達，進而提高了轉基因擬南芥和小麥對鹽的耐受性，由此說明不同WRKY轉錄因子在感知鹽脅迫下的基因表達存在相同的現象。在模擬干旱脅迫下，SbWRKY71基因在6 h時受到顯著誘導，其他時間點維持在相同水平，在擬南芥中，WRKY71的過表達能誘導擬南芥種子萌發，并對干旱脅迫顯得更加敏感，說明WRKY71基因可能是響應干旱脅迫的一個功能基因。在flg22、elf18模擬生物脅迫下，SbWRKY71基因的表達量在較短時間內被顯著抑制，這與桑樹(Morusalba)中MaWRKY29的研究結果一致[34]，說明WRKY轉錄因子在參與植物先天免疫應答過程中具有重要作用。

有研究指出，水稻WRKY71轉錄因子OsWRKY71基因在耐冷過程中主要起正調控作用[35]；同時在擬南芥中，過表達AtWRKY71基因有助于增強植物對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的敏感性[36]；推測SbWRKY71基因在病原侵染及冷脅迫應答過程中也可能有類似的功能，因此本研究有望為今后進一步研究SbWRKY71基因的功能奠定基礎。

4 結論

本研究結果表明，從高粱中克隆的SbWRKY71基因是一個帶有典型WRKY結構域的WRKY家族成員，根據多序列比對，高粱SbWRKY71與玉米親緣關系最近，編碼364個氨基酸，蛋白質分子質量為38.95 kDa，其理論等電點為8.5(堿性蛋白)。RT-qPCR結果表明，SbWRKY71基因表達具有組織特異性，且受植物激素、干旱、鹽脅迫以及PAMPs的影響。本研究為進一步揭示WRKY71基因的生物學功能，以及在調節高粱抗性和響應植物激素等過程中的作用提供了基礎。