利用GFP基因的黃瓜T-DNA插入突變體構建與快速鑒定

馮路路 王雪艷 夏 磊 王團團 李 季，* 陳勁楓

(1南京農業大學園藝學院，作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095；2江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇 南通 226541)

黃瓜(CucumissativusL.)是一種重要的蔬菜作物，其栽培歷史悠久[1]。近年來，隨著黃瓜基因組測序的完成及基因工程技術的不斷發展，越來越多的重要功能基因被定位并克隆出來，發現新基因和發掘基因功能已經成為黃瓜功能基因組學研究的重要任務[2]。突變體是研究基因功能最直接、最有效的試驗材料之一，相較于野生型植株，突變體往往僅在某一個基因位點發生變化，避免了其他位點的干擾[3]，對基因功能研究具有重要價值。由于黃瓜的遺傳基礎較為狹窄[4]，自然變異的頻率很低，因此，人為創制突變體進行基因功能研究已成為必然。

突變體的創制途徑主要包括物理誘變、化學誘變及插入突變等，近年來的基因編輯技術作為一種定向創制突變體的方法已廣泛應用于番茄(SolanumlyeopersicumMill.)[5]、水稻(OryzasativaL.)[6]及擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]中，黃瓜中也有相應報道。其中，插入突變具有研究無表型基因、易獲得突變位點、易于進行反向遺傳學研究等諸多優點[8]，是一種較為適合創制植物突變體的方法。隨著農桿菌介導的轉基因技術不斷發展，T-DNA插入破壞基因廣泛應用于功能基因組學研究[9]。目前，利用T-DNA插入創制突變體的方法已經成功應用于構建擬南芥[10]和水稻[11]突變體庫，并對相關突變體的突變基因功能進行了分析，明確了花青素[12]、穗形態[13]以及葉片夾角[14]等農藝性狀相關的重要基因。前人多是利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulphonat, EMS)來創制黃瓜突變體，如王晶等[15]利用EMS誘變獲得了有關株型、葉片、花器官以及果實性狀的黃瓜突變體；薛紅霞等[16]利用EMS誘變得到了葉型、葉色、果實長度、株型等多個類型的黃瓜突變體。在葫蘆科插入突變體創制方面，任海英等[17]利用T-DNA插入突變得到一個蔓枯病抗性明顯增強的甜瓜突變體edr2。李蕾等[18]將T-DNA插入應用于黃瓜突變體構建中，并利用PCR和斑點雜交技術對T-DNA插入突變體進行了驗證。Hu等[19]通過基因編輯技術敲除了黃瓜中的CsWIP1基因，該基因的突變使黃瓜植株由雌雄同株轉變為全雌株，并在轉基因后代中篩選得到非轉基因的純合突變體Cswip1。

利用T-DNA插入的方法創制突變體往往需要高效的遺傳轉化體系。Trulson等[20]早在1986年就首次成功獲得黃瓜轉基因材料，在過去三十多年中，研究者對黃瓜的遺傳轉化方案進行了基因型[21]、外植體[22]、選擇標記[23]等多方面的優化，但目前的黃瓜遺傳轉化體系依舊存在著轉化效率低、轉基因遺傳穩定性差等問題。本研究在南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室已經建立的農桿菌介導的黃瓜子葉節遺傳轉化體系的基礎上，從農桿菌活力、共培養溫度等方面進行進一步優化，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)報告基因為插入基因，利用TAIL-PCR進行T-DNA插入突變體的T-DNA側翼序列進行擴增，確定T-DNA的插入位點，對插入基因的功能進行初步解析，以期得到更高效的遺傳轉化體系，為黃瓜功能基因組學研究提供一定的技術和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于遺傳轉化的黃瓜材料為南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室保存的長春密刺高代自交系CCMC。農桿菌菌株C58、表達載體pGreen0029均由南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室提供。DNA提取試劑盒購自Omega Bio-Tek_安諾倫(北京)生物科技有限公司，Genome Walking Kit試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。植物組培材料在南京農業大學葫蘆科作物遺傳與種質創新實驗室組織培養室中培養，培養條件為溫度25℃，光周期16 h/8 h (晝/夜)。再生植株在人工氣候箱中培養，培養條件為溫度28℃/25℃ (晝/夜)，光周期18 h/6 h (晝/夜)，相對濕度70%～75%。

1.2 試驗方法

1.2.1 農桿菌介導的黃瓜子葉節法轉化方法 以CCMC為受體材料，選取飽滿的種子進行消毒，接種到無菌培養基上。待種子生長至下胚軸直立子葉未張開的狀態，將植株生長點剔除后，保留1/3子葉和2 mm下胚軸的子葉節作為轉化外植體接種于預培養基[MS + 6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)1.5 mg·L-1) + 脫落酸(abscisic acid，ABA)0.2 mg·L-1]上，黑暗條件下培養1 d。

挑取攜帶植物表達載體pGreen0029的農桿菌單菌落進行活化培養，之后將其制備成OD600為0.5的侵染液。將經預培養的外植體置于農桿菌重懸液中侵染20 min，然后將侵染完成的外植體置于共培養基(MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ ABA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)100 μmol·L-1]上黑暗培養3 d后轉到選擇培養基[MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ ABA 0.2 mg·L-1+ Kan(卡那霉素)100 mg·L-1+ 特美汀(timentin, TM)200 mg·L-1]上繼續培養。

1.2.2 農桿菌生長曲線的測定 取剛活化好的菌液400 μL加入50 mL配置好的液體YEB培養基中在28℃重新搖菌，在24 h內每隔2 h吸取10 μL不同稀釋程度的菌液接種于配置好的YEB固體培養基中，28℃倒置避光培養30 h，然后對培養基上長出的農桿菌單菌落進行計數，根據稀釋倍數得到各個時間段單位菌液中的活細菌數量并測定其OD600值，并制作農桿菌的生長曲線。

1.2.3 共培養溫度處理對轉化效率的影響 農桿菌侵染操作方法同1.2.1，將侵染完成的外植體接種于共培養基上分別在18、23、28、33℃條件下黑暗培養3 d，然后轉接至選擇培養基上培養15 d后對外植體進行熒光觀察，統計不同溫度條件下的外植體的再生率以及轉化率，重復3次。

1.2.4 利用GFP報告基因篩選轉化外植體 以pGreen0029載體為轉化載體，該載體的T-DNA插入序列為綠色熒光蛋白基因GFP的表達單元，因此當T-DNA成功插入到植物宿主細胞中時，GFP可以作為報告基因，在外植體分化培養15 d左右進行熒光觀察，將外植體置于MVX10宏觀變倍體式熒光顯微鏡下(日本Olympus公司)，在GFP通道(460～550 nm)下對外植體進行熒光觀察。未轉化的外植體由于葉綠體自發熒光而顯現為紅色，被轉化的外植體由于會表達GFP則顯現為綠色。為了準確評估轉化事件，將整體表達GFP信號的愈傷組織或再生芽認定為陽性愈傷或陽性芽，愈傷組織或再生芽上僅分散有GFP表達細胞的不能認定為陽性愈傷或陽性芽。

1.2.5 利用GFP報告基因鑒定轉化植株 將篩選得到的外植體經過分化、伸長、生根后進行馴化，待植株生長健壯后取轉化植株的葉片、卷須、花芽以及根系等部位置于MVX10宏觀變倍體式熒光顯微鏡下，在GFP通道(460～550 nm)下進行GFP信號的表達觀察。并將轉化植株置于植物活體成像系統中，對轉化植株整體的GFP熒光表達情況進行觀察鑒定。

1.2.6 TAIL-PCR克隆T-DNA側翼序列 DNA試劑盒[安諾倫(北京)生物科技有限公司]提取已經馴化的一株T-DNA插入黃瓜突變體和野生型黃瓜幼嫩葉片的總DNA，具體步驟參考產品說明書。利用Premier 5.0軟件在T-DNA右邊界設計3個巢式引物SP1、SP2和SP3(表1)，引物AP1、AP2是由Genome Walking Kit試劑盒[寶日醫生物技術(北京)有限公司]提供的經過特別設計的退火溫度較低的兼并引物。按照試劑盒說明對黃瓜T-DNA插入突變體的T-DNA側翼序列進行擴增，將第三輪PCR產物經凝膠電泳鑒定后送往南京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果在葫蘆科作物基因組數據庫(http://cucurbitgenomics.org/)網站進行序列比對分析。根據得到的插入位點，在T-DNA載體序列中設計特異性引物M-F，在插入位點旁臨的基因組序列中設計特異性引物M-R，利用這對特異性引物對突變體進行鑒定。

表1 試驗所用引物序列

2 結果與分析

2.1 黃瓜遺傳轉化體系優化

在農桿菌介導的黃瓜遺傳轉化的體系中，農桿菌自身活力是影響侵染成功率的關鍵因素。細菌培養增殖有四個時期：遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期，處于對數期的細菌具有更好的活力[24]。農桿菌活力鑒定通常采用OD值法，但該方法測定的菌液濃度同時包含了活菌和死亡菌，不能準確地反映農桿菌的真實活力，本研究通過測定農桿菌活化培養過程中不同時間點單位菌液中的活菌數目(CFU·mL-1)，制作農桿菌生長曲線。由圖1可知，農桿菌活化8～20 h，菌群處于對數生長期；20 h之后，雖然OD值仍在上升， 但活菌統計顯示菌群已進入衰亡期。綜合菌群活力和菌體數量，本研究認為農桿菌活化培養12～18 h時，菌液具有最佳的活力。

圖1 農桿菌生長曲線圖

共培養階段是農桿菌完成對植物細胞侵染的時期，共培養階段的溫度、時間、培養基成分以及pH值都是影響轉化效率的關鍵因素[25]。本研究對不同共培養溫度處理轉化外植體2周后統計其再生率和陽性誘導率，由表2可知，只有共培養溫度為33℃時外植體再生率最低，僅為21.29%，顯著低于其他溫度條件下培養的外植體，說明共培養階段高溫會抑制外植體的分化。28℃是最適宜農桿菌生長的溫度，但陽性誘導率的統計結果顯示，當共培養溫度為23℃時陽性誘導率最高為2.26%，顯著高于28℃下的轉化率。綜合外植體的再生率和陽性誘導率，本研究認為23℃是最適的共培養溫度。

表2 共培養溫度對黃瓜子葉節轉化的影響

2.2 利用綠色熒光蛋白GFP的突變體快速鑒定

在外植體侵染完成后分化培養2周，統計外植體的分化率并進行GFP熒光觀察。觀察結果顯示，綠色熒光在不同類型的組織中均有表達。白色且質地松散的非胚性愈傷組織中，GFP信號較弱，僅在愈傷表面呈松散分布(圖2-A、E)；在綠色的質地較為致密的愈傷組織中，GFP信號較為集中地分布在愈傷突起部位(圖2-B、F)，這類愈傷再生率較高；在再生芽中，熒光信號分布也有不同表現，例如在嵌合體的再生芽中，成功轉化的組織部位可以清晰檢測到熒光信號，而未轉化部位無熒光信號(圖2-C、G)。相比之下，由轉化細胞發育而來的陽性再生芽，其各個組織部位均能檢測到較強的熒光信號(圖2-D、H)。在通過體式熒光顯微鏡的快速鑒定后，將具有較強熒光信號的胚性愈傷組織或再生芽的外植體繼續繼代培養，同時切去各熒光組織部位周圍的無熒光再生芽。

注：A、B、C和D分別是明場下的具有非胚性愈傷的外植體，具有胚性愈傷的外植體，轉基因嵌合體，具有陽性芽的外植體；E、F、G和H分別是具有非胚性愈傷的外植體，具有胚性愈傷的外植體, 轉基因嵌合體，具有陽性芽的外植體。

利用優化后的遺傳轉化體系創制T-DNA插入突變體，通過GFP熒光表達的篩選，最終從2 978個黃瓜轉化子葉節外植體中得到3株GFP陽性植株，遺傳轉化率為1.00‰。將篩選得到的陽性外植體進行馴化，待植株生長健壯后對植株的葉片、花芽、卷須以及根系等部位進行GFP信號表達觀察，發現這些組織部位均有GFP信號的表達(圖3)。利用活體成像系統對整個植株進行GFP熒光表達觀察，發現轉化植株整體均有不同程度的GFP熒光信號，其中，轉化植株的葉脈和生長點等組織部位熒光信號最強，為700 cps(counts per second)；嫩葉和卷須等組織部位熒光信號強度次之，為400 cps；衰老葉片和葉片邊緣等組織部位熒光信號強度最弱，為50 cps(圖4)。

注：A、B、C和D分別是明場下轉基因植株的葉片、花芽、卷須和根系；E、 F、G和H分別是轉基因植株的葉片、花芽、卷須和根系。

注:右側光標顯示生物發光強度值范圍為 (紫色端) 50～1 800 cps (紅色端)。

2.3 突變體插入位點的分子鑒定

以未轉化長春密刺植株(圖5-A)為對照，對T0突變體T-DNA-PG-1(圖5-B)的株型、雄花、雌花以及葉片形態等性狀進行比較觀察，結果顯示，T0植株與野生型植株相比無明顯差異。為檢測T-DNA插入突變體中T-DNA的插入位置，本研究采用TAIL-PCR對T-DNA插入突變體進行T-DNA的側翼序列擴增，分別利用Genome Walking Kit試劑盒中的簡并引物AP1、AP2和自行設計的序列特異性引物SP1、SP2、SP3對已經馴化的1株T-DNA插入突變體的基因組DNA進行3輪PCR擴增，在使用簡并引物AP1的第三輪PCR擴增結果中得到了一段大于2 000 bp的DNA片段(圖6-B)，然后將該第三輪PCR產物測序，得到736 bp的準確DNA序列。利用DNAMAN軟件將測序結果與載體序列進行比對，發現測序結果前160 bp的DNA序列中有112 bp的DNA序列與載體序列一致，然后將測序結果在葫蘆科作物基因組數據庫(http://cucurbitgenomics.org/)網站進行序列比對，測序結果中位于193～704之間共512 bp的DNA片段與黃瓜基因組第一條染色體的20 011 698～20 011 187的DNA片段100%匹配，因此，初步將T-DNA插入突變體的T-DNA插入位置定位于第1條染色體上CsaV3_1G032940基因的第10個外顯子中，推測該基因是一類蛋白激酶。

注：A: 野生型植株；B: 突變體T-DNA-PG-1。

為了進一步驗證TAIL-PCR的鑒定結果，在T-DNA載體上設計特異性引物M-F，距離T-DNA右邊界1 149 bp。然后在基因組中設計特異性引物M-R，距離T-DNA右邊界插入位點401 bp(圖6-A)。利用設計的這一對引物對黃瓜野生型植株和T-DNA插入突變體植株的DNA進行擴增。在黃瓜T-DNA插入突變體植株的DNA中，由于有T-DNA載體插入，可以擴增出預期約1 550 bp的片段；而在野生型植株的DNA中，由于未插入T-DNA載體，不能擴增出預期大小的DNA片段(圖6-C)。將得到的PCR產物進行測序，測序結果顯示PCR擴增序列和預期的序列結果基本一致，進一步確定了T-DNA插入突變體的T-DNA插入位置。

注：A: T-DNA在第一條染色體的插入位點；B: TAIL-PCR擴增轉基因植株的側翼序列；C: T-DNA插入位點的驗證。M: DNA maker；1～3: 兼并引物AP1的第1、2、3輪TAIL-PCR擴增；4～6: 兼并引物AP2的第1、2、3輪TAIL-PCR擴增；7: 水；8: 野生型植株; 9、10: 轉基因植株。

3 討論

報告基因具有可靠、便捷和靈敏度高等優點，是一種較為適合鑒定轉基因植株的方法，目前β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，GUS)和GFP是黃瓜遺傳轉化體系中應用最為普遍的報告基因。GUS是一種廣泛應用于轉基因快速檢測的報告基因[26]，但GUS無法進行活體檢測，在外植體再生階段時只能對再生芽進行破壞性的檢測。相比之下，利用GFP熒光觀察可以活體鑒定轉基因材料，且操作簡單觀測結果準確，能有效減少假陽性的問題。Priyadarshani等[27]利用GFP報告基因對菠蘿進行遺傳轉化使轉基因菠蘿的篩選變得簡單、無損；Jung等[28]利用GFP監測技術檢測辣椒早期發育階段的轉基因，提高辣椒遺傳轉化效率；Hu等[19]利用GFP報告基因在外植體發育早期對黃瓜轉基因植株進行鑒定，在共培養3 d之后就能檢測到微弱的熒光信號。因此，利用GFP作為報告基因在外植體發育早期就可以進行篩選鑒定，更為簡便快捷。本研究以GFP作為報告基因，在轉化外植體分化2周后進行熒光觀察鑒定陽性轉化事件，避免了大量再生芽的馴化、DNA提取及PCR檢測等工作，并利用GFP報告基因對成熟的陽性植株各組織部位進行觀察鑒定，極大提高了轉基因植株的篩選效率。

共培養階段是農桿菌對植物細胞完成侵染的關鍵時期，共培養溫度對T-DNA的轉移有著明顯影響。農桿菌的最適生長溫度為28℃，但農桿菌的最適生長溫度不一定是農桿菌具備最強侵染效力的溫度。Fullner等[29]研究認為，T-DNA轉移的最適溫度為19℃，最利于T-DNA復合物的組裝和轉移。此外，vir基因的誘導和外源DNA片段的整合及穩定表達應在25℃，溫度高于32℃就有可能影響其活性[30]。本研究通過設置不同的共培養溫度進行黃瓜的遺傳轉化，發現當共培養溫度處于23℃時，外植體的分化率和陽性誘導率都優于其他組。

利用T-DNA插入創制突變體的一個顯著優點就是能夠快速得到插入位點的T-DNA側翼序列[31]，為突變基因的定位節省了大量時間。側翼序列的擴增包括TAIL-PCR、質粒拯救、PCR步移以及反向PCR等多種方法，其中TAIL-PCR操作簡便、特異性高、靈敏度高，PCR產物可以直接用于測序，被廣泛應用于各類插入突變體庫側翼序列的分離[32]。本研究利用TAIL-PCR成功分離得到黃瓜T-DNA插入突變體的T-DNA側翼序列，通過對黃瓜基因組進行序列比對，確定T-DNA片段插入到CsaV3_1G032940基因(BHP)的外顯子中，該基因在擬南芥中的同源基因為AT4G18950，與植物介導藍光依賴性氣孔開放有關[33]，但目前在正常栽培條件下，該基因的T-DNA插入突變體與野生型表型無明顯差異，在今后的研究中會對該基因在突變體中的表達以及該突變體在藍光條件處理下的表型鑒定進行深入研究。

4 結論

本研究確定了農桿菌C58的菌液最佳取樣時期為搖菌后12～18 h，農桿菌侵染的最佳共培養溫度為23℃，并利用GFP報告基因顯著提升了轉化植株的篩選效率，同時通過TAIL-PCR成功克隆得到突變體的T-DNA側翼序列，進一步確定了突變體的插入位點，此方法能有效應用于黃瓜的遺傳轉化中，并為黃瓜及葫蘆科其他作物的相關研究提供了參考。但侵染效率過低仍是限制轉化效率的最主要原因，后續研究將進一步從黃瓜基因型篩選、轉化載體的選擇、共培養處理方式等方面開展轉化體系優化，同時開展黃瓜花粉管通道法、花粉磁轉染等轉化技術的探索。