桃PpMADS1的克隆及對類胡蘿卜素合成基因的調控研究

余 凡 秦 娟 柴吉釧 方筱琴 曹士鋒 陳 偉 施麗愉 楊震峰,*

(1 浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100；2 上海海洋大學食品學院，上海 201306)

類胡蘿卜素是黃色、橙色和紅色果實中重要的呈色物質，是一類天然色素的總稱。類胡蘿卜素作為有效清除單線態氧和自由基的抗氧化劑[1]，不僅可以提高健康成年人大腦認知能力[2]，還能夠降低白內障等眼部疾病[3]及癌癥[4]的發病率。近年來，隨著人們對營養健康關注度的提高，人們對類胡蘿卜素等功能性物質需求也越來越大，因此，深入揭示果實中類胡蘿卜素的形成與調控研究正日益受到人們的廣泛關注。

高等植物類胡蘿卜素的生物合成在質體中進行，遵循類異戊二烯途徑，涉及的酶包括八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)、番茄紅素ε環化酶(lycopene ε-cyclase，LCYE)、番茄紅素β環化酶(lycopene β-cyclase，LCYB)、β-羥基酶(β-hydroxylase，CHYB)和玉米黃質環氧酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)。目前編碼這些酶的結構基因已經在柑橘[5]、越桔[6]、榴蓮[7]、番木瓜[8]以及芒果[9]等許多果實中得到克隆和鑒定，且發現不同物種果實中參與類胡蘿卜素合成代謝的關鍵基因存在差異。

MADS-box轉錄因子是植物中研究最廣泛的轉錄因子家族之一[10]。MADS-box轉錄因子在植物所有器官的形成發生及植物生長發育的全過程都扮演了重要角色[11]。近年來，有關MADS-box轉錄因子參與果實成熟及品質形成調控的研究已經在番茄(Solanumlycopersicum)及多年生果樹上陸續報道。但有關MADS-box轉錄因子參與調控果實類胡蘿卜素合成與積累的研究還主要集中在模式植物番茄中。研究發現，番茄果實成熟過程中類胡蘿卜素的積累由多個MADS-box轉錄因子共同調控，且不同MADS-box成員在果實成熟期間的表達模式存在差異，對類胡蘿卜素合成的調控機制也不同。TAGL1、SlMADS-RIN、SlMBP15和SlCMB1都是番茄中正調控果實類胡蘿卜素合成的轉錄因子，它們的沉默表達均減少了果實中類胡蘿卜素的積累，降低了PSY1和PDS表達水平[12-15]。但這4個MADS-box基因中只有TAGL1和SlMADS-RIN的表達量與果實成熟期間類胡蘿卜素的積累相一致；SlMBP15表達量在果實成熟期間呈先上升后下降趨勢，并在果實轉色期達最高值；而SlCMB1表達量在整個成熟過程中逐漸下降。SlMADS1、SlFYFL和SlMBP8是負調控番茄果實類胡蘿卜素積累的轉錄抑制因子，但它們在果實成熟期間表達模式不同，SlMADS1和SlFYFL表達量逐漸下降，而SlMBP8表達量反而逐漸上升[16-18]。SlMADS1通過抑制PSY1基因表達降低類胡蘿卜素的含量，SlMBP8對PSY1、PDS和ZDS基因均有轉錄抑制作用。

類胡蘿卜素物質的合成與積累是黃肉桃果實呈色的重要原因[19]。目前，有關桃果實類胡蘿卜素生物合成的分子機制已有一些研究。Cao等[20]報道黃肉桃果實采后貯藏期間類胡蘿卜素積累與PpPSY和PpCHYB的高表達密切相關。PpCHYB基因的差異表達也是導致套袋和不套袋桃果肉中類胡蘿卜素含量差異的重要原因[21]。轉錄調控層面進行的桃果實類胡蘿卜素合成的有關研究鮮見報道。為此，本研究以黃肉桃金麗和白肉桃湖景為試驗材料，克隆得到1個MADS-box基因PpMADS1，并對該基因進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測PpMADS1基因在桃不同組織以及不同發育階段的表達情況，并利用雙熒光素酶試驗分析PpMADS1對類胡蘿卜素合成基因PpPSY和PpCHYB啟動子的轉錄調控作用，旨在為揭示MADS-box轉錄因子對桃果實類胡蘿卜素合成的轉錄調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為浙江省寧波市德馨園生態農業科技有限公司種植的金麗及湖景水蜜桃品種。采集試樣芽、幼葉、花、軟核果實、硬核果實等不同組織樣，S1(盛花后35～45 d)、S2(盛花后55～65 d)、S3(盛花后95～105 d)、S4(盛花后105～120 d)和S5(盛花后120～150 d)期不同成熟度果實。采集完的樣品于1 h內運送回實驗室，將各組織及成熟度的樣品于液氮中研磨成粉末狀，儲存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用改進的植物RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek公司，美國)，根據使用說明提取不同組織和不同成熟度果實的總RNA。采用無RNase活性的DNaseI(Omega Bio-Tek公司，美國)去除總RNA中微量DNA污染，以備后續cDNA合成。采用NanoDro-p2000核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific，美國)測定RNA樣品的濃度和純度。通過Gel DOC XR+凝膠成像儀(美國BIO-RAD)觀察提取的RNA條帶的完整性、大小和清晰度。按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)說明書進行cDNA合成。

1.2.2 桃果實PpMADS1基因的克隆 利用桃基因庫(http://www.plantgdb.org/PeGDB/)以及桃果實發育時期轉錄組數據庫篩選獲得1個MAD-box基因家族候選基因ppa010595m，對其進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，發現ppa010595m與預測的桃AGx3(GeneBank登錄號為XM_020561783.1)序列一致，因此將ppa010595m命名為PpMADS1基因。利用Primer 5.0軟件根據基因序列設計PCR擴增特異性引物(表1)，委托上海生物工程技術有限公司進行引物合成。以合成的cDNA為模板，使用PCR技術擴增PpMADS1基因的開放閱讀框(oper reading frame, ORF)。反應體系：5.8 μL ddH2O，0.2 μL dNTP Mix，2 μL SF Buffer，1 μL cDNA模板(濃度約為250 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL，Phanta Super-Fidelity DNA pdynerase 0.2 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；95℃變性8 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃終延伸10 min。PCR擴增產物經電泳檢測后，回收純化連接到pMD18-T 載體上，轉化大腸桿菌DH5α，過夜培養，經過菌落PCR挑取篩菌板上陽性克隆子，通過搖瓶培養提質粒送華大基因測序。

1.2.3PpMADS1的生物信息學分析 利用ExPASy Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對PpMADS1轉錄因子的氨基酸序列、蛋白質分子量、氨基酸組成、理論等電點、脂溶指數、親水指數等一級理化性質進行分析。利用SOPMA在線網站對PpMADS1蛋白的二級結構進行預測。利用在線工具Protcomp9.0進行亞細胞定位分析。利用swissmodel在線軟件(http://swissmodel.expasy.org)對蛋白的三級結構進行預測。利用NCBI網站的BLAST工具對PpMADS1進行同源性比對分析，利用NCBI、ClustalX2.0、GeneDoc軟件對PpMADS1與同源基因進行氨基酸序列比對分析。利用進化樹分析軟件MEG4.1(http://www.megasoft-ware.net)中的鄰接(neighbor-joining，NJ)法[執行參數：Poission correction correction、pairwise deletion和boot-strap(1 000次重復)]對PpMADS1轉錄因子進行進化樹分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 采用CFX96 Touch Real-Time PCR系統(Bio-Rad，美國)，利用熒光定量引物進行3步法qRT-PCR擴增。qRT-PCR 程序設置為95℃初始變性7 min，95℃保持15 s，45℃退火30 s，75℃保持15 s，進行39個循環。以PpTEF2基因(引物見表1，退火溫度為59℃)作為內參基因，設置陰性對照。采用2-ΔΔCT方法進行qRT-PCR的數據分析，設置3次生物學重復。

1.2.5 雙熒光素酶試驗 利用高保真酶Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技有限公司)和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)將PpPSY和PpCHYB啟動子序列插入pGreenII 0800-LUC載體的熒火蟲熒光素酶(firetty luciferase, LUC)上游作為報告基因，將PpMADS1的ORF序列重組到pGreenII 62-SK載體上作為效應基因。陰性對照為空載體pGreenII 62-SK。構建載體所需引物見表1。

表1 引物序列

農桿菌侵染煙草及轉錄激活活性測定試驗參考Ba等[22]的方法，效應基因和報告基因培養液的混合比例為8∶1，用醫用針筒吸取混合液侵染葉片背面，置于恒溫培養箱3 d，利用雙熒光素酶報告分析試劑盒(Promega，美國)和Luminoskan Ascent化學發光分析儀(Thermo，美國)測定葉片侵染區中螢火蟲光素酶(firefly luciferase，LUC)與海腎熒光素酶(renilla luciferase，REN)催化產生的熒光信號的比值。PpMADS1對PpPSY和PpCHYB啟動子的轉錄調控活性通過LUC/REN比值來計算，歸一化為陰性對照，每個處理重復4次。

2 結果與分析

2.1 PpMADS1基因的克隆及序列分析

以桃果實cDNA為模板克隆得到長度為732 bp的PpMADS1的ORF序列見圖1。PpMADS1基因編碼的氨基酸一級結構預測值見表2，PpMADS1蛋白酸堿性氨基酸組成比例和理論等電點顯示其呈堿性。不穩定指數和脂溶指數表明PpMADS1不穩定，具有較好脂溶性。親水指數表明PpMADS1表現出親水性。

Note: M: Marker.

表2 PpMADS1蛋白基本理化性質

2.2 PpMADS1蛋白的結構分析

如圖2所示，PpMADS1蛋白的二級結構預測結果中α-螺旋占55.97%，β-轉角占4.12%，延伸鏈約占8.64%，無規則卷曲占31.28%，說明PpMADS1蛋白的二級結構以α-螺旋為主要構成元件，這與PpMADS1蛋白的三級結構預測結果相一致(圖3)。對PpMADS1蛋白進行亞細胞定位分析發現，PpMADS1定位在細胞核中的可能性最大，符合轉錄因子的功能定位特征。

圖2 PpMADS1蛋白的二級結構預測

圖3 PpMADS1蛋白的三級結構預測

2.3 PpMADS1氨基酸序列分析

從NCBI數據庫中下載桃PpMADS1基因的同源序列，物種包括烏梅(Prunusmume)，中國櫻桃(Prunuspseudocerasus)，野黑櫻桃(Prunusserotina)，粳稻(Kerriajaponica)，蘋果(Malusdomestica)，沙梨(Pyruspyrifolia)，白梨(Pyrusxbretschneideri)，番茄等。同源性分析發現PpMADS1與烏梅(XP_008225496.1)的氨基酸相似率最高，達到100%，與中國櫻桃(AIU94283.1)氨基酸序列相似率達到99.59%，僅有少量氨基酸存在差異。將PpMADS1與番茄中已被證明對類胡蘿卜素合成代謝有調控作用的基因SlMADS1[16](NP_001234380.1)、SlCMB1[15](XP_004237061.1)、SlMADS-RIN[13](NP_001234670.1)、SlFUL1[23](NP_001234173.2)、SlFYFL[17](AHG98096.1)、TAGL1[24](NP_001300859.1)、SlMBP15[14](NP_001352611.1)進行同源分析，他們的同源性分別為43.95%、46.12%、44.50%、47.54%、46.55%、65.82%、38.64%。利用ClustalX及Genedoc軟件對PpMADS1氨基酸序列與其他6個物種的MADS蛋白氨基酸序列進行比對(圖4)，結果發現PpMADS1蛋白的N端包含MADS轉錄因子家族共有的特征MADS結構域，同時包含了Ⅰ(intervening)region、k(keratin-like)-box以及相似的C端結構[25-26]，PpMADS1蛋白C端有含有植物AG-motif特征序列，這說明桃PpMADS1屬于MADS-box轉錄因子AG亞族。

注：PpS：Prunus pseudocerasus. Ps: Prunus serotina. Kj: Kerria japonica. Ppy: Pyrus pyrifolia; Pxb: Pyrus x brets chn eideri. Md: Malus domestica.

2.4 PpMADS1系統進化樹分析蛋白

為進一步研究桃PpMADS1蛋白的系統進化關系，用NJ法分析了與其同源性較高的扁桃、中國櫻桃、烏梅、蘋果、歐洲櫻桃、野黑櫻桃、白梨、東京櫻花、粳稻、沙梨相關MADS家族基因的進化關系。由圖5可知，與PpMADS1蛋白親緣關系較近的是扁桃、東京櫻花和中國櫻桃。同為李屬的扁桃、烏梅、歐洲櫻桃、野黑櫻桃、中國櫻桃、東京櫻花聚為一類，粳稻、蘋果、沙梨和白梨聚于一類，表明不同植物間的系統進化關系具有明顯的種屬特征。

圖5 PpMADS1基因系統發育樹

2.5 PpMADS1時空表達分析

PpMADS1基因在金麗和湖景不同組織中的表達模式一致，即PpMADS1在芽、葉中幾乎不表達，在花和果實中大量表達，湖景花中PpMADS1表達量顯著高于金麗，金麗軟核和硬核果實中PpMADS1表達量都顯著高于湖景(圖6)。在2個品種桃果實成熟過程中PpMADS1表達量整體呈下降趨勢；成熟度S1時期，金麗果實中PpMADS1表達量顯著高于湖景；成熟度S2時期，湖景果實中PpMADS1表達量顯著高于金麗；成熟后期(S4～S5),湖景果實中PpMADS1表達量都顯著低于金麗果實(圖7)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

圖7 不同成熟度果實中PpMADS1基因的表達

2.6 PpMADS1轉錄因子對PpPSY和PpCHYB基因啟動子的轉錄調控特性

利用同源重組方法將PpPSY和PpCHYB基因啟動子融合LUC報告基因，將PpMADS1融合62-sk效應基因(圖8-A)。雙熒光素酶試驗結果如圖8-B所示，與空載體相比，PpMADS1轉錄因子顯著提高了PpPSY和PpCHYB啟動子的轉錄活性(P<0.05)，說明PpMADS1轉錄因子對PpPSY和PpCHYB啟動子具有轉錄激活作用。

注：A: 載體構建原理圖；B: PpMADS1對PpPSY、PpCHYB啟動子的調控作用。

3 討論

MADS-box轉錄因子家族是目前在植物領域研究最廣泛的轉錄因子家族之一，調控著植物的營養生長和生殖生長過程，在果實成熟與品質調控方面具有顯著作用[27]。本研究從桃果實中克隆得到一個桃MADS-box基因，將其命名為PpMADS1。MADS-box家族不同成員基因具有相對保守的序列，蛋白結構存在相似性。生物信息學分析表明，PpMADS1編碼蛋白呈堿性，二級結構中α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲及三級結構中的蛋白質折疊的空間構象具有較高的保守性，具有較好的脂溶性，蛋白質結構不穩定，且為親水蛋白，PpMADS1蛋白特征與其他植物MADS基因家族的研究結果基本一致[28]。亞細胞定位預測顯示PpMADS1定位于細胞核，具有轉錄因子特征。同源性分析表明，不同物種來源的MADS-box蛋白具有較高同源性，其中桃PpMADS1與扁桃、烏梅、中國櫻桃、東京櫻花等李屬MADS-box蛋白相似性較高。

在模式植物番茄中研究發現果實成熟過程中類胡蘿卜素的積累是由多個MADS-box轉錄因子共同調控，包括正調控轉錄因子TAGL1、SlMADS-RIN、SlMBP15、SlCMB1以及負調控轉錄因子SlMADS1、SlFYFL和SlMBP8[12-18]。在這些番茄MADS-box轉錄因子中，桃PpMADS1與TAGL1序列相似度最高，達65.82%；PpMADS1與TAGL1氨基酸序列上都含有AG亞族特有的典型基序，因此都屬于MADS-box轉錄因子AG亞族[29]；在不同組織中，PpMADS1與TAGL1基因在芽、葉中幾乎不表達[12]，在花和果實中大量表達；且成熟后期黃肉桃金麗果實比白肉桃湖景有更高的PpMADS1表達水平，這與Cao等[20]報道黃肉桃金麗果實含有更高類胡蘿卜素含量相一致，上述結果暗示PpMADS1可能具有與TAGL1相似的基因功能，即可能也對果實類胡蘿卜素的積累起正調控作用。八氫番茄紅素合成酶PSY被認為是類胡蘿卜素合成的限速酶[30]。番茄果實中PSY基因超量表達可有效促進果實類胡蘿卜素的積累[31]。TAGL1轉錄因子正是通過上調PSY1和PDS表達水平，促進番茄果實類胡蘿卜素的積累[12]。董新甜等[21]研究發現套袋和不套袋桃果肉間PpCHYB基因的差異表達可能是導致兩種果實類胡蘿卜素含量差異的重要原因。Cao等[20]報道黃肉桃金麗果實采后貯藏期間類胡蘿卜素積累與PpPSY和PpCHYB基因的高表達密切相關。這些結果表明PpPSY和PpCHYB是黃肉桃果實類胡蘿卜素合成的關鍵基因。在此基礎上，本研究通過雙熒光素酶試驗發現，PpMADS1轉錄因子對PpPSY和PpCHYB基因啟動子具有轉錄激活作用，進一步驗證了PpMADS1轉錄因子可能通過調控PpPSY和PpCHYB基因表達促進桃果實類胡蘿卜素合成。但PpMADS1轉錄因子調控桃果實類胡蘿卜素合成與積累的具體分子機制有待進一步深入研究。

4 結論

本研究從金麗和湖景2個品種桃果實中克隆得到PpMADS1的ORF序列，長度為732 bp，編碼243個氨基酸。生物信息學分析表明PpMADS1蛋白可能為堿性，具有較好的脂溶性，不穩定，表現出親水性，定位于細胞核。PpMADS1與烏梅的氨基酸序列相似率最高，達到100%，氨基酸序列具有典型的MADS家族特征結構域及AG亞族特種基序，屬于MADS-box轉錄因子家族AG亞族基因。qRT-PCR和雙熒光素酶試驗結果表明，PpMADS1轉錄因子可能通過調控PpPSY和PpCHYB基因表達促進桃果實類胡蘿卜素合成。本研究為進一步揭示PpMADS1轉錄因子在果實成熟過程中調控類胡蘿卜素合成代謝的分子機制提供了理論依據。