蒸汽爆破對紅豆和綠豆多酚含量及抗氧化活性的影響

谷春梅 候春宇,3 程安瑋

(1 吉林農業大學食品科學與工程學院， 吉林 長春 130118；2 湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；3 山東省農業科學院農產品研究所， 山東 濟南 250100)

我國豆類資源豐富，種植區域廣。目前統計的豆類有上百種，現今規模種植的有20余種，其中綠豆、紅豆已成為我國主要的雜糧資源。研究表明，綠豆、紅豆富含生物活性成分，如黃酮類、酚酸類等物質[1-3]，有較顯著的抗氧化效果，可抑制生物大分子的氧化[4]。李洪飛等[5]研究表明，綠豆中有大量的多酚物質，含量高達48.546 mg·g-1。程安瑋等[6]研究發現紅豆、綠豆中酚類和黃酮類物質含量豐富，有較強的抗氧化活性。李思荻[7]研究發現紅豆中總酚含量達到4.341 8 mg·g-1， 且對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH)自由基及羥自由基清除能力明顯高于花蕓豆、白蕓豆等原料。韓玲玉等[8]研究了7種雜糧的抗氧化活性，發現綠豆的抗氧化能力表現較好。Shi等[9]系統研究了我國20種綠豆中營養及活性成分，表明豆類中富含結合態和游離態酚酸以及黃酮類等功能成分，且具有一定的抗氧化活性。

植物自身組成結構為其內部有效成分的提取構筑了一道天然屏障，限制了有效成分的提取，影響溶質與溶劑的接觸可及性和溶解過程以及溶劑夾帶溶質通過植物結構的傳質擴散過程。因此，在對有效成分提取前需對原料進行預處理，打破上述提取屏障，以達到理想的提取速度和得率。爆破加工作為一項當前新近發展起來的預處理手段，已逐漸應用到食品加工行業。該技術借用高溫和高壓共同作用于樣品，且瞬時釋壓過程會促使樣品的組分分離，通過與其他提取技術相結合，可達到物料在組分水平、細胞水平和組織水平的分級分離[10]。劉翀等[11]研究證明蒸汽爆破可使麥麩中游離酚酸的提取率增加50%以上，但爆破處理對紅豆和綠豆中活性成分的影響還尚待研究。多酚、類黃酮作為豆類中的重要活性物質，由于原料特性、活性物質的組成及結構等不同，對高溫高壓等因素的敏感性不同，因此本試驗選用色澤差異明顯的紅豆和綠豆為原料，探討采用不同的壓力和作用時間進行爆破處理，對紅豆和綠豆中總酚、總黃酮的釋放量及提取率的影響，通過體外DPPH、鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2-2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid, ABTS)]等試驗研究爆破加工對其抗氧化活性的影響，確定量-效關系，以期探明爆破加工對食品原料中重要活性成分多酚的釋放及相應抗氧化效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆、綠豆樣品購于濟南市場。福林酚試劑、沒食子酸、DPPH(純度≥98%)，上海源葉試劑公司；無水乙醇、甲醇、Na2CO3、AlCl3等為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；FRAP試劑盒、ABTS試劑盒，上海碧云天生物公司；蘆丁，自提(純度≥98%)。

1.2 儀器與設備

QBS-80爆破試驗臺，鶴壁正道生物能源有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；FW177高速萬能粉碎機，浙江大德儀器廠；LXJ-IIB離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司；CP413電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；Synergy HTX多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；LRH系列生化培養箱，上海恒科技有限公司；Quanta200型掃描電子顯微鏡，荷蘭Fei公司；TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒸汽爆破預處理 紅豆、綠豆用蒸餾水(加水量剛好沒過原料)浸泡5 h后，撈出，控干水分，裝于自封袋中密閉平衡水分過夜；正式蒸汽爆破之前空爆數次，保證壓力的穩定性。將樣品置于物料倉中，通入飽和水蒸汽，壓力分別選取0.25、0.50、0.75、1.00 MPa，時間分別選取30、60、90 s，在極短的時間內釋壓(閥門打開時間0.008 75 s)，完成爆破處理；以未進行爆破的豆子為對照組(CK)。將處理完的豆子收集，于50℃烘干至恒重，避光保存。將不同處理的紅豆和綠豆樣品粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 微觀結構觀察 用導電膠將適量樣品固定于樣品臺上，用洗耳球吹去樣品表面的雜質，采用離子濺射方法鍍金，立即放入電鏡載物腔體內抽至真空，加高壓(5 kV)[12]，然后分別用由小到大的放大倍數進行觀察和拍照。

1.3.3 紅外掃描圖譜分析 紅外掃描圖譜采用溴化鉀壓片法。稱取2 mg原料粉末與150 mg干燥的溴化鉀粉末放于研缽中混合，研磨3 min后將混合物放置在硫酸紙上倒于壓模中，抽真空后去壓力，放于紅外光譜儀內在波段400～4 000 cm-1掃描。

1.3.4 超聲波輔助提法 按料液比1∶20(g·mL-1)加入50%乙醇溶液，常溫下400 W超聲40 min后，4 500 r·min-1離心15 min，分離上清液和沉淀。沉淀繼續加入50%乙醇溶液，再次提取，合并上清液。

1.3.5 總酚含量的測定 采取福林酚法測定多酚含量[13-14]。取豆類提取液100 μL，加2 mL蒸餾水和200 μL福林酚試劑混勻，3 min后加入900 μL 20% 的Na2CO3溶液，用移液槍反復吹吸混合液，吹打均勻后避光存放2 h，測定765 nm波長處的吸光度值。以沒食子酸為標品，在濃度為10～500 μg·mL-1內做標準曲線(y=0.003x+0.033 9，R2=0.997 5)，計算豆類提取液中的總多酚含量(total phenols content，TPC)。

1.3.6 總黃酮含量的測定 采用AlCl3法測定總黃酮含量[15]。取1.5 mL提取液與1.5 mL的2% AlCl3-甲醇溶液(5%乙酸)混合均勻，暗處理10 min，測定430 nm波長處的吸光值。以蘆丁為標品，在濃度為10～500 μg·mL-1內做標準曲線(y=0.003 7x+0.032 8，R2=0.997 3)， 計算樣品中的總黃酮含量(total flavonoids content, TFC)。

1.3.7 抗氧化活性的測定 DPPH自由基清除能力的測定[16]：取8 μL提取液，加入80 μL的DPPH(0.1 mmol·L-1)溶液，混合均勻后加入112 μL無水乙醇，室溫避光放置70 min，測定517 nm波長處的吸光度值。

式中，A1為樣品溶液的吸光度；A0為初始吸光度。

按照有關試劑盒說明書測定FRAP、ABTS的抗氧化活性。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 爆破加工對紅豆和綠豆外觀結構的影響

由圖1可知，未經爆破的紅豆和綠豆的表面均勻光滑，結構完整。爆破時間分別為30、60、90 s時，隨著壓力的不斷增大，紅豆和綠豆表皮顏色逐漸加深，破裂顆粒數逐漸增多，伴隨著糊化現象。爆破壓力為0.25 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆和綠豆的顏色逐漸加深，表皮出現褶皺。當爆破壓力為0.50 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆表皮呈近黑褐色，綠豆逐漸變為淺褐色，且紅豆和綠豆表皮均出現破裂。當爆破壓力為0.75 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆和綠豆發生破裂，紅豆表皮顏色逐漸變為黑色，綠豆變為棕褐色。當爆破壓力為1.00 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆和綠豆表皮破裂顆粒數有所增加，糊化嚴重，甚至出現結塊，產生焦糊氣味。說明高壓或長時間的爆破處理可能使紅豆和綠豆產生不同程度的美拉德反應，導致酚類化合物、黃酮類化合物的分解損失，原料糊化現象嚴重，這可能與原料結構破裂的程度有關。

圖1 爆破加工對紅豆(A)和綠豆(B)外觀的影響

2.2 爆破處理對紅豆和綠豆中微觀結構的影響

爆破加工過程中，原料會發生各種反應，比如原料顆粒的減少和微孔的擴張。由圖2可知，未爆破的紅豆和綠豆表面和整體結構完整，不利于活性成分的溶出。當爆破壓力為0.25和0.50 MPa時，隨著爆破時間的延長，兩樣品的結構受到破壞，多數變為不規則形狀，在90 s時綠豆結構破裂嚴重。當爆破壓力為0.75和1.00 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆和綠豆表面結構發生破裂，形成大量的碎片物質。這可能是由于在爆破加工過程中，紅豆和綠豆結構內部會充滿過熱的飽和蒸汽，釋壓后蒸汽會使原料結構及細胞壁發生破壞，形成顆粒狀物質，紅豆和綠豆的表面積增大，促進原料中活性成分與溶劑的接觸可及性，利于多酚類化合物的溶出。

圖2 爆破加工對紅豆(A)和綠豆(B)微觀結構的影響(×500)

2.3 紅外圖譜分析

多酚類物質常見的特征鍵有羥基與其他基團形成的氫鍵、甲氧基C-H、芳烴骨架C=C和C-O鍵等。張叔良[17]研究發現，分子中的羥基與其他基團結合形成的氫鍵特征吸收峰為3 500～3 200 cm-1，由此推測紅豆和綠豆羥基基團的吸收峰分別位于3 403.8 和3 426.9 cm-1(圖3)。2 931.3和2 922.6 cm-1是分子中的甲氧基C-H伸縮振動的吸收峰；紅豆中的1 657.5 和1 541.8 cm-1吸收峰，綠豆中的1 657.5和1 540.8 cm-1吸收峰是芳烴骨架C=C鍵伸縮振動吸收峰；1 394.3和1 384.7 cm-1是甲氧基C-H面內彎曲振動吸收峰；紅豆中1 248.7、1 156.1 和1 059.1 cm-1，綠豆中1 238.1、1 153.2 和1 030.8 cm-1可能是C-O-C伸縮振動吸收峰。對比圖中譜線后發現經過爆破加工的紅豆和綠豆，無新化學結構和官能團產生。與CK相比，爆破處理組紅豆在3 403.8 和2 931.3 cm-1處的吸收有所增強，爆破處理組綠豆在3 426.9 和2 922.6 cm-1處的吸收峰強度增大，這可能是由于爆破加工使原料中的分子鏈斷裂導致羥基增多。

圖3 爆破加工前后紅豆(A)和綠豆(B)的紅外光譜圖

2.4 爆破處理對紅豆和綠豆中總酚含量的影響

由圖4可知，與CK相比，爆破壓力和時間對原料中總酚的提取率有明顯的影響，爆破后的原料中總酚含量明顯增加。30 s爆破時間下，兩樣品中總酚的含量隨著爆破壓力增加呈增加趨勢，至壓力為1.00 MPa時其含量下降。60 s爆破時間下，綠豆中總酚含量在0.50 MPa時達到最大(4.57 mg·g-1)，隨后有降低的趨勢，而紅豆中總酚的含量在0.75 MPa時達到最大(4.66 mg·g-1)。90 s爆破時間下，紅豆中總酚含量隨著爆破壓力增加而升高，爆破壓力增加至0.75 MPa后總酚含量有降低趨勢；而綠豆在1.0 MPa壓力下明顯下降。總體來看，紅豆中的總酚含量高于綠豆(除0.5 MPa、60 s處理組)。

圖4 爆破處理對紅豆、綠豆中總酚含量的影響

當爆破壓力為0.25 MPa時，紅豆和綠豆中總酚含量隨著爆破時間的延長而增加。當爆破壓力為0.50 MPa時，綠豆中總酚含量在爆破時間增至到60 s時達到最高，隨后下降，紅豆中總酚含量隨爆破時間延長呈增加的趨勢。爆破壓力為0.75 MPa時，紅豆中總酚含量在60 s時最高，綠豆中總酚含量隨著爆破時間的延長呈下降趨勢。爆破壓力為1.00 MPa時，隨著爆破時間的延長，紅豆和綠豆中總酚含量明顯下降，在90 s時兩樣品中多酚含量達到最低值，分別為2.48和2.22 mg·g-1，略高于CK。一般認為，谷物、豆類中的多數酚類化合物常與蛋白質、糖類、纖維素等大分子結合，導致提取不易[18]。經爆破加工后，原料的物理、化學結構發生較大變化，會產生類似酸水解、氫鍵斷裂和結構重排等協同作用[19]，促使原料中的木質素、纖維素和半纖維素發生不同程度的降解，與大分子相結合的酚類物質得到大量釋放，所以在較低的爆破壓力下，總酚含量隨著時間延長而不斷提高。但是，酚類物質并不能隨著爆破條件的提高而無限增加，紅豆和綠豆中總酚含量呈現明顯的先升后降的變化趨勢，在1.00 MPa時，總酚含量降低明顯，可能是因為高溫會造成酚類物質的分解[20]，過高強度的爆破會造成酚類物質損失。

2.5 爆破處理對紅豆和綠豆中總黃酮含量的影響

由圖5可知，與CK相比，爆破處理組樣品的總黃酮含量明顯上升，0.75 MPa、60 s條件下紅豆中總黃酮的含量最高(3.07 mg·g-1)，0.5 MPa、60 s條件下綠豆總黃酮含量最高(3.0 mg·g-1)，分別是CK的2.32和1.74倍。通過比較發現，各爆破處理組總黃酮含量的變化趨勢與總酚含量基本一致。爆破加工可提高物料結構的多孔性，導致高滲透率和低力學強度，有利于蒸汽的有效滲入，物理作用破碎效果更明顯，提高物料孔隙率和孔體積增長率，增加溶質與溶劑的接觸可及性，從而增強活性成分的提取效果；由于原料自身組成結構及質地等不同，活性物質提取的最佳爆破條件也不同，但是過度的爆破處理如高壓或長時間爆破可導致酚類物質的降解，也可發生美拉德反應產生褐變，甚至會引起原料基質的碳化[21-22]。

圖5 爆破處理對紅豆、綠豆中總黃酮含量的影響

2.6 爆破處理對紅豆和綠豆提取物抗氧化能力的影響

由圖6可知，爆破處理組樣品的抗氧化能力均高于CK，紅豆的抗氧化活性明顯高于綠豆(除0.5 MPa、60 s爆破組)。在0.75 MPa、60 s條件下紅豆提取物的抗氧化能力最強，而綠豆在0.50 MPa、60 s條件下最強。各爆破處理組樣品的DPPH自由基清除率、FRAP還原能力、ABTS抗氧化能力的變化趨勢基本與總酚、總黃酮含量一致。蒸汽爆破處理對紅豆和綠豆的抗氧化成分如酚類物質的釋放是有限的，達到一定的爆破強度后，樣品清除DPPH自由基、清除ABTS自由基，以及樣品FRAP還原能力的效果不再明顯，而更高強度爆破處理可能造成抗氧化成分的損失[20]，導致樣品清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力以及FRAP還原能力均有所降低。

圖6 爆破處理對紅豆、綠豆提取物抗氧化能力的影響

2.7 紅豆和綠豆提取物與抗氧化活性之間的相關性分析

由表1可知，紅豆中，總酚含量與抗氧化活性之間的r值均在0.9以上；總黃酮含量與抗氧化活性之間的r值有一定差異，其中總黃酮含量與DPPH自由基清除率之間相關性最高。綠豆中，總酚含量與抗氧化活性之間的r值有一定差異，表現為FRAP>DPPH>ABTS，但r均<0.9，明顯低于紅豆提取物的r值；除DPPH自由基清除率外，總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性高于紅豆提取物與其的相關性，其中綠豆總黃酮的含量與ABTS自由基清除率之間的相關性最高，r為0.893。由此可知，紅豆和綠豆的抗氧化能力與其總酚、總黃酮含量密切相關，抗氧化能力與總酚、總黃酮含量存在顯著的相關性。

表1 原料提取物與抗氧化活性之間的相關性

3 討論

蒸汽爆破作為一種農產品原料預處理新技術，具有類酸性水解、熱降解、類機械斷裂、氫鍵破壞以及結構重排等多種作用，可使纖維素和半纖維素的葡萄糖苷鍵水解，同時使半纖維素和木質素產生一些有機酸，降解為分子物質，使纖維疏松具有多孔性[23-24]。爆破加工過程中，原料會發生各種物理、化學反應，包括微孔的擴張，整體形狀的變化等，結構破裂嚴重，形成大量的碎片物質，促進原料中活性成分與溶劑的可及接觸，有利于多酚類化合物的溶出。宋洪東[25]發現爆破加工處理松針，其表面完整的結構變為多個小粒子物質，提高了黃酮類物質的提取率。本研究也驗證了蒸汽爆破可通過改變綠豆和紅豆的外觀及微觀結構，提高酚類物質的提取率。廖雙泉等[26]對椰衣進行爆破加工處理，將其纖維進行紅外分析，發現原料中無新結構出現，但其主要吸收峰增強，呈現纖維素的吸收，與本研究結果相一致。

影響爆破效果的主要因素有爆破壓力(溫度)、保留時間、原料等，由于原料性質等不同，最佳的爆破條件以及爆破效果也存在差異。Qin等[27]將爆破加工技術用于無花果葉中，0.2 MPa下爆破3 min其類黃酮提取率增加55.9%。Wang等[28]研究表明豆類在220℃下爆破120 s其總酚的提取效果最佳。籽粒莧籽實在0.6 MPa、60 s的蒸汽爆破條件下多酚的提取率最高，再增加爆破強度多酚提取率反而下降[29]。趙夢麗等[21]利用蒸汽爆破處理小麥麩皮時，在爆破壓力為2.5 MPa時，可溶性總糖和游離型酚酸含量達到最大值，增加壓力至3.88 MPa，二者含量呈下降趨勢。這些研究結果證實，就蒸汽爆破對原料中活性物提取效果來看，不同的原料其最佳爆破參數差異性很大。本研究結果也證實了紅豆、綠豆等豆類物質經過爆破處理，其酚類物質、類黃酮等成分的提取含量增加，可能是因爆破加工使原料中的分子鏈斷裂產生的基團增多，隨著爆破壓力和時間的不斷增大，易造成酚類物質的降解，酚類物質、類黃酮的提取率有降低趨勢。紅豆和綠豆分別在0.75 MPa、60 s和0.50 MPa、60 s的爆破條件下，酚類物質的提取率達到最高。

已有研究證實多酚、類黃酮等成分有較強的抗氧化能力。闞麗嬌[30]發現，26種蕓豆中總酚含量與FRAP還原能力存在正相關性。任順成等[31]發現15種豆類有較明顯的抗氧化效果。Amarowicz等[32]發現紅豆中多酚類物質含量豐富，并分別用β-胡蘿卜素亞油酸體系法、總抗氧化活性法、DPPH法證實，豆類提取物中的酚類物質表現出明顯的抗氧化效果。孫丹等[18]和袁佐云等[33]的研究也得出類似的結論，表明樣品中的多酚、類黃酮等成分是發揮其抗氧化活性的重要成分。爆破加工對原料中多酚、類黃酮等物質的提取率具有明顯的影響，而提取物的抗氧化效果也產生了一定的變化，Gong等[34]證明爆破后青稞麩皮的ABTS清除能力從326提高到2 983 TEAC mg·100 g-1DW；劉翀等[11]研究表明，爆破處理麥麩后其多酚及抗氧化活性明顯上升，兩者之間具有明顯的相關性。本研究結果表明，爆破加工后紅豆和綠豆提取物總酚、總黃酮的含量明顯上升，通過DPPH、ABTS、FRAP等體外抗氧化試驗證實其抗氧化能力明顯增強，它們之間呈極顯著正相關性。

4 結論

本研究結果表明，適當的蒸汽爆破處理是一種有效的預處理方法，可使原料的結構發生破裂，形成大量的碎片物質，爆破處理后的紅豆和綠豆中無新化學結構和官能團產生，在羥基基團處的吸收峰強度增大，爆破處理后紅豆和綠豆樣品中總酚、總黃酮的提取率有明顯的提升，爆破壓力和作用時間對其有明顯的影響。由于原料的質地結構及組成不同，最佳的爆破參數不同，本研究中紅豆的最佳條件為0.75 MPa、60 s，綠豆的為0.50 MPa、60 s。紅豆中的總酚、總黃酮的含量均高于綠豆，除0.50 MPa、60s爆破處理組。蒸汽爆破處理可以促進豆類原料中多酚、類黃酮成分的釋放，其抗氧化活性也得到明顯提升，呈極顯著正相關。本研究結果可為爆破加工適用于不同種類生物質及有效成分的提取提供理論指導，拓展爆破加工技術在食品加工行業的應用范圍。