干燥方式和粉碎程度對蘋果皮全粉理化特性及酚類生物利用度的影響

馬千程 易建勇 畢金峰,* 趙圓圓 吳昕燁 陳芹芹

(1 大連工業大學食品學院， 遼寧 大連 116034；2 中國農業科學院農產品加工研究所/農業農村部農產品加工重點實驗室， 北京 100193)

蘋果是日常膳食中酚類物質的主要來源之一。蘋果中的酚類物質大部分來源于果皮，其含量是果肉的2～7倍，且抗氧化能力更強[1]，具有很高的利用價值。蘋果皮是蘋果深加工過程中產生的副產物，除部分應用于發酵飼料和農業堆肥外，其余均未得到有效利用，造成了資源浪費和環境污染。Alibas等[2]將微波干燥后的蘋果皮添加到涼茶飲料中以豐富涼茶的香氣和營養；Rupasinghe等[3]通過添加經對流熱風干燥粒徑為1 mm的蘋果皮粉，提高了松餅中膳食纖維和總酚的含量以及抗氧化活性。因此，若將廢棄的蘋果皮加工成蘋果皮全粉，既可以充分回收蘋果皮中大量的酚類物質，提高蘋果全果的綜合利用率，又可以減少因處理不當而導致的環境污染。同時，蘋果皮制粉后具有良好的耐儲性和便攜性，可作為膳食輔料滿足特殊消費需求。

干燥方式和粉體粒徑會顯著影響果蔬粉的加工特性和營養物質溶出特性。目前蘋果皮干燥應用較多的是傳統熱干燥方式，如熱風干燥、滾筒干燥等[4-6]。但另有研究[1]表明真空冷凍干燥與熱風干燥相比可以更大程度地保持物料本身的形態、色澤和營養成分；熱泵干燥因可以控制空氣濕度，回收熱量，比熱風干燥更溫和、高效[7]。超微粉碎是改善粉體物理和營養特性的有效途徑，通過機械力或流體動力將原料粉碎至微米級[8]，增大粉體顆粒比表面積和孔隙率等，從而改善粉體的均一性、流動性和溶解性等[9]。此外，超微粉碎還會增大細胞破碎率，使活性成分更易通過細胞膜/壁，提高其在人體小腸部位的吸收，如褚洪標等[10]研究發現，適度的微粉化(中位徑為27.02 μm)可以促進厚樸粉中多酚在胃腸中的溶出。但目前尚鮮見不同粉碎程度對蘋果皮粉品質影響的研究。盡管人們日常攝入的食物中含有大量酚類物質，但實際上只有少部分(0.5%～1%)能夠通過人體胃腸消化過程進入小腸上皮細胞而被吸收代謝[11-12]，因此研究不同制粉方式對蘋果皮全粉中酚類物質在人體消化過程中的生物利用度十分必要。

本研究通過真空冷凍干燥(vacuum freeze-drying，FD)和65℃熱泵干燥(heat pump drying，HP)以及不同時間的超微粉碎制備蘋果皮全粉，全面探究不同制粉方式對蘋果皮全粉粒徑、色澤、微觀結構和粉體行為特性(壓縮性、容積密度和流動性)的影響，并利用體外模擬胃腸消化模型，探討加工后蘋果皮全粉中酚類物質的生物利用度，旨在為蘋果皮制粉加工和新產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用山東富士蘋果，購買于北京清河小營市場，貯藏于4℃冷庫。

胃蛋白酶(≥250 U·mg-1)、胰蛋白酶(8×USP)、福林酚試劑，美國Sigma公司；氯化鈉、碳酸氫鈉、無水乙醇、濃鹽酸、豬膽鹽，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，美國Thermo Fisher試劑公司；沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、金絲桃苷、蘆丁、根皮苷等標準品、10 kDa透析袋，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Alpha1-4Lplus真空冷凍干燥設備，德國Christ公司；ZWH-KFY-BT4I/HG閉環除濕熱泵干燥機，東莞正旭新能源科技有限公司；DE-100萬能高速粉碎機，衢州普潤日用品有限公司；KCW-10超微粉碎振動磨，北京錕捷玉誠機械設備有限公司；S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac公司；CM-700D1手持分光色差儀，日本Konica Minolta公司；S-570掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；FT4多功能粉末分析儀，英國Freeman Technology公司；UV1800紫外分光光度計，日本島津公司，Waters-1525高效液相色譜，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果皮全粉制備 取新鮮無傷病的蘋果，清水輕洗，手工削皮，獲得厚度約3 mm有果肉附著的蘋果皮，隨后立即進行干燥，直至果皮干基水分含量低于0.06 g·g-1。

FD：將果皮置于干燥托盤，于-80℃預凍12 h后，放入凍干機中。設置真空度0.01 kPa，冷阱溫度-55℃， 托盤溫度25℃，干燥時間約48 h。

HP：干燥溫度65℃，濕度12%，風速2.0 m·s-1, 干燥時間2 h。

利用高速粉碎機將干燥的蘋果皮粗粉碎，打粉15 s，間歇15 s，重復3次后，過20目篩，得到蘋果皮粗粉樣品FD-c和HP-c；利用振動磨將蘋果皮粗粉超微粉碎5和25 min，分別過100目和200目篩，得到樣品FD-5、HP-5、FD-25和HP-25，密封保存在干燥器中，盡快測定其物理指標，隨后保存于-20℃，用于測定酚類物質。

1.3.2 粒徑分布的測定 通過激光粒度分析儀測定蘋果皮全粉的粒徑分布情況并計算粒徑分布的離散度[13]。

(1)

式中，D10、D50和D90分別表示10%、50%和90%的粉體可以通過的粒徑大小。

1.3.3 微觀結構的測定 將待測樣品分散固定于粘有導電膠的載物臺上，通過離子濺射儀對樣品表面噴金，將其置于掃描電子顯微鏡下，在600倍和3 000倍下觀測粉體的微觀形態[14]。

1.3.4 色澤測定 利用手持色差計，經黑白板校正后，對樣品池中的粉體進行色澤測定，記錄明度指數L*、色品指數a*和b*，L*值越大，亮度越大；a*值越大，顏色越紅；b*值越大，顏色越黃。

1.3.5 容積密度、壓縮性和流動性測定 采用多功能粉末分析儀測定蘋果皮全粉的行為特征參數[15]。將樣品填滿25 mL規模的玻璃杯，測試前設備自動對樣品進行一次預處理以消除粉體顆粒間的殘余應力和空氣。選用Compressibility模式測定粉體容積密度和壓縮性，其中螺旋攪拌角度5°，攪拌速度40 mm·s-1，壓力參數6 kPa，壓力時間1 min。選用Flowability模式測定粉體流動性，測定攪拌速度為10、40、70、100 mm·s-1，得到的BFE(basic flowability energy)值為粉體基本流動能，表示粉體流動時所需外界提供的能量。

1.3.6 酚類物質提取 準確稱取0.3 g樣品粉于50 mL離心管中，加入10 mL 80%甲醇，室溫下避光超聲1 h，然后于11 000 r·min-1離心10 min，取上清液，沉淀物中再加入10 mL 80%甲醇，重復操作2次，合并3次的上清液，用80%甲醇定容至30 mL，得到消化前的酚類物質提取液(undigested samples, US)，于4℃冰箱保存待測。

1.3.7 體外模擬胃腸消化 參考Bouayed等[16]的方法。

胃消化：取0.3 g蘋果皮全粉于50 mL錐形瓶中，加入7.5 mL 9 mg·mL-1氯化鈉溶液，1.2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液和0.6 mL活性胃蛋白酶溶液，調節pH值至2.0，于37℃、100 r·min-1水浴振蕩1 h。一份離心取上清液，定容至20 mL，即為胃消化提取液(gastric digestion samples，GS)，在-20℃保存待用；另一份繼續進行小腸消化。

小腸消化：用9 mg·mL-1氯化鈉溶液沖洗透析袋內外，一端用棉線系緊，按1∶1的體積比在透析袋中加入9 mg·mL-1氯化鈉溶液和0.5 mol·L-1碳酸氫鈉溶液，系緊另一端，浸沒在上述胃消化提取液中，于37℃、100 r·min-1水浴振蕩45 min，此時錐形瓶中溶液的pH值應為6.5～7.0。繼續加入2.7 mL活性胰酶-膽汁混合液(2 mg·mL-1胰液和12 mg·mL-1膽汁提取物溶解于0.1 mol·L-1碳酸氫鈉)于錐形瓶中，調節pH值為7.0～7.5，于37℃、55 r·min-1水浴振蕩2 h。消化完成，取出透析袋，將透析袋內液體定容至5 mL，即為可透析酚溶液(dialysis samples, DS)；剩余液體離心取上清液，定容至20 mL，即為小腸消化提取液(intestinal digestion samples, IS)，保存于-20℃。另設空白組(不加食物基質)，消化過程與樣品條件一樣。

根據公式計算酚類物質的生物利用度[17]：

(2)

式中，BA為酚類物質的生物利用度，%；BCdialysed為所透析酚溶液中的酚類物質的含量，μg·g-1；BCnon-digested為消化前酚類物質提取液中酚類物質的含量，μg·g-1。

1.3.8 酚類物質測定 采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法，將各單酚標準品、US、GS、IS和DS經0.45 μm微孔濾膜過濾后分別上機進行梯度洗脫。色譜條件：Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為2%乙酸，B相為甲醇；柱溫：35℃；全波長檢測；流速：1.0 mL·min-1；進樣量: 10 μL。根據各單酚標準品的出峰時間和出峰面積對照樣品中的酚類物質進行定性定量。

1.4 數據統計與分析

每組樣品至少進行3次測定，采用Excel 2007軟件進行數據處理，Origin 8.5軟件進行繪圖，SPSS Statistics 20軟件進行方差分析，試驗結果均以干基表示。

2 結果與分析

2.1 粒徑分布

通常將粒徑小于25 μm的粉末定義為超微粉[18]。由表1可知，不同干燥方式對同一粉碎時間的粉體粒徑分布無顯著影響。粉碎時間越長，粉體粒徑越小，其中，FD-25和HP-25粉體的D50分別為24.95和25.04 μm，其粒徑均顯著小于粗粉，說明這兩種樣品中至少有50%粉體達到了超微粉級別。離散度可以反映超微粉碎的效果，其數值越小，粉體越均一，分散性和溶解性越好[19]。與粗粉相比，超微粉碎蘋果全皮粉的離散度顯著下降，但不同超微粉碎時間對粉體的離散度無顯著影響。

表1 不同制粉方式蘋果全皮粉粉體粒徑分布

2.2 微觀結構

由圖1可知，在同等放大倍數下，蘋果皮粗粉顆粒較大，其中FD粗粉顆粒的形狀比HP完整，而HP粗粉顆粒的形狀多為不規則的厚片狀。經超微粉碎后，粉體顆粒的大小明顯減小，隨著振動磨的沖擊和研磨，部分顆粒趨于球狀，表面趨于光滑。此外，3種不同粒徑的粉體中均出現了團聚現象，但圖像中未發現粉體粒徑大小與團聚程度之間的關系。

2.3 色澤變化

色澤作為判斷果粉質量最直觀的指標，影響著果粉作為功能性食品輔料的使用范圍。如表2所示，不同粉碎時間對蘋果皮全粉的色澤影響顯著，與兩種粗粉相比，超微粉碎后的蘋果皮全粉L*和a*值變大，b*值變小，說明其粉體亮度增加，紅色變深，黃色變淺，蘋果皮全粉整體由肉色趨于淺粉色，與圖2所示相符。這可能是由于蘋果皮中纖維含量較多，與果肉相比不容易被輕易磨碎，因此隨著碾磨、剪切和沖擊等機械力的持續作用，紅色的果皮被進一步粉碎混勻，致使果粉呈現趨于淺粉色的狀態。

圖2 不同粒徑蘋果皮全粉外觀圖

表2 不同粒徑蘋果皮全粉的色澤變化

2.4 粉體特性

FT4多功能粉末分析儀測定粉體行為特性有別于休止角、卡爾指數等靜態表征的方法，其可模擬不同加工過程和實際應用中的不同環境，具有動態表征技術[20]。

2.4.1 流動性 粉體的流動性對加工過程各操作單元及成品品質均有影響。BFE值越低，代表粉體流動性能越好[21]。由圖3可知，FD-c和HP-c的粉體流動性相對穩定，隨著超微粉碎時間的延長，FD與HP蘋果皮全粉的BFE值呈現不同變化趨勢，但未發現粉體粒徑與流動性之間的關聯性，這與左力旭等[15]和張明等[22]的粉體粒徑越小，其流動性越差的結論不同，可能是因為超微粉碎使粉體顆粒性質變得不穩定，加劇了團聚現象的發生，從而影響了流動性。在相同超微粉碎時間下，不同干燥方式的蘋果皮全粉表現出不同的流動性，其中FD-5粉體BFE值最小，在所有粉體樣品中流動性最好，FD-25粉體的流動性最差，而HP-5和HP-25粉體的流動性趨勢與對應的FD粉體相反。

注：10、40、70、100表示不同的測試速度。

2.4.2 容積密度和壓縮性 容積密度是指單位體積內粉體顆粒的質量，它與粉體的壓縮性成反比。由圖4可知，與粗粉相比，同一干燥方式下超微粉碎后的蘋果皮全粉容積密度顯著增加，壓縮性顯著降低，其中FD-25和HP-25粉體的容積密度分別是其粗粉的1.16和1.14倍，其壓縮性分別是其粗粉的77.43%和72.76%。而超微粉碎5與25 min的粉體之間在壓縮性方面差異不顯著。此外，FD蘋果皮全粉的容積密度小于HP粉，壓縮性大于HP粉。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 體外模擬消化對蘋果皮全粉單酚組成的影響

根據標品的出峰時間和出峰面積，確定不同制粉方式的蘋果皮全粉在消化前后，其可溶性多酚的組分和含量的變化如表3所示。在消化前的US中檢測到的蘆丁和綠原酸是蘋果皮全粉中含量最豐富的2種酚類物質，蘆丁在HP-c中的含量最高(1 888.35 μg·g-1)， 綠原酸在FD-c中含量最高(1 053.57 μg·g-1)。在相同粉碎時間下，HP樣品中綠原酸和表兒茶素的含量低于FD；除超微粉碎25 min的粉體外，HP樣品中金絲桃苷和蘆丁的含量顯著高于FD，在相同干燥方式下，綠原酸和表兒茶素的含量隨著粉碎時間的延長而降低。

表3 蘋果皮全粉體外模擬消化前后酚類物質組成變化

經胃消化后，樣品中的蘆丁含量升高，達到了消化前的1.05～1.47倍，同時4種酚類物質含量下降，其降解程度按降次排序分別為表兒茶素(30.50%～34.08%)、根皮苷(22.36%～32.94%)、金絲桃苷(12.48%～21.58%)和綠原酸(10.53%～15.94%)。此外，在GS中還檢測出新的酚類物質——兒茶素，其含量為142.41～165.48 μg·g-1。經小腸消化后，兒茶素含量增加了2.00～2.34倍，而其他酚類物質在腸消化中的降解程度明顯高于胃部消化，其中表兒茶素降解完全，除FD-c與FD-5粉體外，其余樣品中的綠原酸也降解完全，金絲桃苷、蘆丁和根皮苷與消化前相比分別降解了約41.45%、76.37%和44.95%。這與酚類物質的結構特征有關。

與IS中酚類物質的含量相比，透析過程導致兒茶素、金絲桃苷、蘆丁和根皮苷分別損失了43.07%～57.34%，37.36%～58.55%，14.67%～43.39%，17.99%～33.94%。在DS中得到的可透過小腸上皮細胞的酚類物質含量與消化前(US)酚類物質含量的比值乘以100%即為該物質的生物利用度，它取決于酚類物質的結構特性、與其他成分(如蛋白質和多糖)的相互作用以及其從食物基質中的釋放量[11,23]。由表4可知，酚類物質生物利用度按降次排序分別是兒茶素(202.94%～282.90%)、根皮苷(39.18%～42.96%)、金絲桃苷(27.16%～33.07%)和蘆丁(15.18%～24.68%)。

表4 蘋果皮全粉中主要酚類物質生物利用度

3 討論

本研究將加工副產物蘋果皮先后經不同干燥方式和不同程度的超微粉碎制備成蘋果皮全粉，結果表明干燥方式和粉碎程度對蘋果皮全粉的粉體特性和酚類物質含量有不同程度的影響，但與胃腸消化后酚類物質生物利用度之間的規律性不明顯。

本研究還發現，蘋果皮經干燥粉碎后產生了團聚現象，這是因為粉體粒徑變小，顆粒比表面積變大，使得顆粒間的表面聚合力和吸附性增大，需要通過團聚使粉體保持穩定[24]，這也是比表面積更大的厚片狀的HP粗粉團聚現象更嚴重的原因。同時，超微粉碎會使蘋果皮細胞中的糖分大量溶出，導致粉體顆粒之間的黏結[25]，加劇了團聚現象的發生。團聚會使粉體小顆粒聚成“大顆粒”[9]，可能造成粉體粒徑和離散度的測量范圍比實際更大。此外，團聚現象也影響了粉體流動性的測定，如FD-5和HP-25，這兩種粉體中可能產生了因團聚形成的“大顆粒”，或者超微粉碎后增加的細粉充當了大顆粒之間的潤滑劑，導致出現“滾珠效應”[26]，使其流動性的測定變得不穩定。

超微粉碎還會使粉體顆粒形狀趨于規則，表面趨于光滑，而這些小顆粒更易填充粉體中的孔隙，導致孔隙減少，粉體壓縮性減小。此外，FD蘋果皮全粉的容積密度略小于HP，這與周葵等[27]和李珂昕等[28]的結論一致，可能是由于不同干燥方式影響了粉體顆粒的質地，FD的蘋果皮細胞結構較為完整，孔壁更薄，使粉體整體質地較為疏松，而HP蘋果皮的細胞結構發生塌陷，形成褶皺，導致其粉體顆粒更緊實致密。

干燥方式和粉碎程度對蘋果皮全粉中酚類物質的含量有一定的影響，這是因為不同單酚的熱敏感性不同，綠原酸和表兒茶素遇熱更易氧化分解[29-30]，而蘆丁、金絲桃苷和根皮苷在65℃條件下相對穩定[31]。同樣，超微粉碎會使研磨腔中的溫度急速升高，導致綠原酸和表兒茶素流失[17]。在模擬胃消化過程中，胃的蠕動作用以及低pH值環境促進了蘆丁從蘋果基質中的釋放[16,32]，而其他酚類物質含量的降低可能由于其未完全釋放或已發生降解，或可能與環境中的胃蛋白酶相結合[33]。此外，胃消化過程中產生的兒茶素可能來源于蘋果皮中的原花青素B2，它在酸性的胃環境中會分解成兒茶素和表兒茶素[34]。在小腸消化過程中，大部分酚類物質都發生了更大程度的降解[33]，其中酚酸類物質在弱堿性的腸液中比黃酮類更加不穩定[11,35]，同時，表兒茶素向兒茶素差向異構化[36]，而兒茶素在腸環境中較為穩定，從而導致了綠原酸、表兒茶素的完全降解和兒茶素的增加，這與Kahle等[34]和Gayoso等[37]的研究結果一致。在透析過程中，仍存在未被酶解的黃酮苷，以及由可溶性游離單酚與消化酶結合成的大分子復合物，由于其無法透過半透膜[15]而造成損失。在DS中檢測出的兒茶素、金絲桃苷、蘆丁和根皮苷均屬于黃酮及其糖苷類，這與Gi?o等[38]的研究結果相似。這4種單酚在透析膜兩側形成被動擴散，最終到達結腸被微生物所利用。

4 結論

本研究采用真空冷凍干燥和65℃熱泵干燥，再經不同時間的超微粉碎制備蘋果皮全粉，探究不同制粉方式對蘋果皮全粉的粒徑分布、色澤、微觀結構、流動性、容積密度和壓縮性以及體外模擬胃腸消化過程中酚類物質生物利用度的影響。結果表明，超微粉碎可顯著減小蘋果皮全粉的粉體粒徑，使粉體顆粒形狀趨于規則、表面趨于光滑，同時改善粉體色澤。與粗粉碎相比，超微粉碎可使粉體容積密度增大、壓縮性顯著降低，便于貯存、運輸。但超微粉碎5和25 min對粉體壓縮性的影響并不顯著，且超微粉碎導致粉體性質變得不穩定，影響了粉體的流動性。此外，真空冷凍干燥加劇了蘋果皮全粉中金絲桃苷、蘆丁和根皮苷的降解，熱泵干燥和超微粉碎加劇了綠原酸和表兒茶素的降解。蘋果皮中酚類物質在胃消化階段相對穩定，主要降解發生在小腸消化階段，經透析后，只有兒茶素、金絲桃苷、蘆丁和根皮苷這4種單酚可進一步被吸收利用，最終發現HP-5粉體的酚類物質生物利用度總體較高。考慮到蘋果皮全粉物理性質的穩定性和酚類物質的生物利用度，65℃熱泵干燥聯合5 min超微粉碎是制備高品質蘋果皮全粉的工藝手段，可有效提高副產物蘋果皮的利用價值，在膳食補充劑等方面具有良好的應用前景。