外源褪黑素和脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗生理特性的影響

劉芯伶,彭玉婷,王云梅,夏 惠,梁 東，胡容平

(1.四川農業大學園藝學院, 四川 成都 611130;2.四川省農業科學院植物保護研究所，四川 成都 610066)

近年來隨著全球氣溫變暖及降水量在時空分布上不均衡的加劇，干旱已成為影響全球農業發展的重要非生物因素[1-2]。獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)，與其他果樹相比，獼猴桃葉片大而薄，葉背被毛，莖具髓心，根為肉質淺根，這些形態結構特征使其對水分脅迫較為敏感[3]。土壤干旱常常會使獼猴桃根系受損，導致其生長受到抑制，同時造成果實綜合品質的下降，嚴重時還會引起葉片的大面積焦枯脫落，甚至導致樹體死亡，給農戶造成巨大的經濟損失[3]。因此，提高獼猴桃抗旱性，已成為其產業發展亟待解決的主要問題之一。

植物生長調節物質是一類少量存在于植物體內，但對植物的生長發育過程起著重要作用的小分子物質，包括生長素、褪黑素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯等。近年研究發現植物生長調節物質在提高植物的抗逆性方面也起著積極的調節作用[4]。褪黑素(melatonin，MT)是一種新型植物激素，廣泛存在于植物體內，具有吲哚類物質結構，可作為抗氧化劑和信號分子在提高植物對冷害[5]、干旱[6]、鹽脅迫[7]及重金屬脅迫[8]等非生物逆境的抗逆性方面起著積極作用。脫落酸(abscisic acid，ABA)對植物生長、發育、抗逆性、氣孔運動和基因表達等都有重要調節功能[9-10]，在植物響應干旱脅迫的ABA依賴途徑中起著信號傳導的關鍵作用[11]。

多見單獨施用MT或ABA提高植物耐旱性的相關研究報道，但關于兩者混合施用對植物干旱脅迫的效果及其生理機理的研究還比較少。本試驗通過單一或混合施用MT和ABA的試驗，綜合分析生長指標、光合特性及抗氧化酶活性等的變化，探究混合施用MT和ABA對干旱脅迫的效果及其作用的生理機制，以期為其在獼猴桃生產應用提供理論依據，為二者在其他果樹上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為盆栽獼猴桃實生苗。于2019年1月選取‘金實1號’的飽滿種子4℃層積，2個月后進行4℃、12 h與25℃、12 h交替的變溫催芽處理。待種子露白后播入穴盤(基質為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1)，放于溫度為25℃±2℃、光強為4 860 μmol ·m-2·s-1(12 h/12 h)的培養室中生長。待第1片真葉展開后，開始澆1/2 Hoagland營養液，每周澆一次，其間補充清水。

1.2 試驗處理

6月中旬，幼苗長至6片真葉，將其移至營養缽(20 cm×20 cm)中，基質為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1，每個營養缽植入3株幼苗，轉移到室外避雨棚內，常規管理。2周后待幼苗適應遮雨棚環境，選取長勢一致的實生苗90盆，平均分為5組進行處理：對照組(CK)、干旱處理組(DCK)、褪黑素處理組(MT+D)、脫落酸處理組(ABA+D)、褪黑素和脫落酸處理組(MT+ABA+D)。重復3次，每重復6盆。干旱處理前，對MT+D處理和MT+ABA+D處理用100 μmol·L-1褪黑素溶液進行根灌，每2 d 1次，共4次，每次200 mL；其他處理根灌等量清水。第4次根灌褪黑素的次日(設為干旱處理0 d)，除CK組正常澆水外，其余處理均進行干旱處理，控制澆水，于干旱的第0、2、4、6、8、10天，對脫落酸處理ABA+D和MT+ABA+D葉面噴施10 mL ABA溶液，濃度為25 μmol·L-1，其余處理組則葉面噴施等量清水。干旱處理的第20天采取各處理組植株從下往上數第4～8節位的葉片，用于相關生理指標測定。

1.3 測定項目及方法

隨機選取每處理組中9株幼苗用于生長指標的測定，株高、根長使用直尺測定，莖粗使用游標卡尺測定莖基部直徑，干重取整株清洗后置于烘箱烘至恒重稱重；光合指標使用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR Inc.，美國)于晴天上午測定；葉綠素含量測定參照Zegaoui Z等[12]的方法；葉片相對含水量測定參照李合生等[13]的方法；葉片水勢使用葉片水勢儀(型號WP4C)測量；脯氨酸含量測定參照李合生等[12]的方法；可溶性蛋白含量采用G-250染色法[12]測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[12]測定；過氧化氫(H2O2)含量采用紫外分光光度計法[12]測定；相對電導率(REL)測定參照向地英等[14]的方法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[12]測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法[15]測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚顯色法[16]測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法[15]測定。

1.4 數據分析

試驗數據均采用平均值±標準誤表示，其統計分析與圖表繪制利用Excel 2010軟件進行，顯著性分析則利用SPSS 20.0軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法進行LSD檢驗(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗生長指標的影響

單一施用脫落酸(ABA)或混合施用褪黑素(MT)和ABA可在一定程度上緩解干旱脅迫對獼猴桃幼苗各生長指標產生的影響(表1)。ABA+D、MT+ABA+D處理組的鮮重分別較DCK處理組高66%和104%左右，差異顯著。MT+ABA+D處理組的干重較DCK處理組高110%左右，差異顯著。植株的根長、莖粗、株高，單一或混合施用MT或ABA均未對其產生顯著影響。

表1 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗生長指標的影響

2.2 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗光合指標的影響

干旱脅迫導致植物光合速率降低[17]，而單一或混合施用MT和ABA可一定程度上提高干旱脅迫下獼猴桃幼苗的凈光合速率。如表2所示，MT、MT+ABA處理組的凈光合速率分別較DCK處理組高36%和29%左右(p>0.05)，且ABA+D處理組的效果最佳，較DCK處理組高40%左右，差異顯著。氣孔導度、胞間CO2、蒸騰速率、水分利用率，單獨或混合施用MT或ABA均未對其產生顯著影響。

表2 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗光合指標的影響

2.3 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片光合色素的影響

干旱脅迫下，植物葉片片層結構受到破壞，導致葉綠素分解[18]，單一或混合施用MT和ABA可緩解干旱引發的葉綠素含量下降。如圖1A所示，ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉綠素a含量分別較DCK處理組高6%和18%左右(p>0.05)。如圖1B所示，ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉綠素b含量分別較DCK處理組高7%和18%左右(p>0.05)。如圖1C所示，MT+D和ABA+D處理組的總葉綠素含量分別較DCK處理組高1%和7%左右(p>0.05)，MT+ABA+D處理組的效果最佳，較DCK處理組高20%左右，差異顯著。

圖1 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of MT and ABA on chlorophyll a, chlorophyll b, and total chlorophyllcontent in kiwifruit seedlings under drought stress

2.4 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對含水量和水勢的影響

植物葉片含水量能較好地指示植物對干旱脅迫的敏感性和耐受性[19-20]，而葉片水勢可指示葉片吸水和保水的能力，是反映體內細胞水分狀況的重要生理指標。葉片水勢參與細胞氣孔的調節，干旱脅迫下葉片水勢降低，氣孔關閉，水分散失減少[21]。如表3所示，MT或MT和ABA的施用可以提高葉片相對含水量和葉片水勢，增加植物對干旱的耐受性。MT+D和MT+ABA+D處理組葉片相對含水量分別較DCK組高9%和4%左右(p>0.05)。MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉片水勢分別較DCK處理組高39%、35%、32%左右，差異顯著。

表3 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對含水量、葉片水勢的影響

2.5 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片滲透調節物質含量的影響

脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖是植物體內最主要的滲透調節物質，干旱脅迫下滲透調節物質大量積累，以降低細胞水勢，維持細胞吸水能力[22]。如圖2A所示，外源激素處理組中，MT+ABA+D處理組的脯氨酸含量最低，較MT+D處理組低78%左右(p>0.05)，較ABA+D處理組低126%左右，差異顯著。如圖2B所示，外源激素處理組中，MT+ABA+D處理組的可溶性蛋白含量最高，較MT+D處理組高10%左右(p>0.05)，較ABA+D處理組高3.5%左右(p>0.05)。如圖2C所示，外源激素處理組中，ABA+D處理組的可溶性糖含量最高，較MT+D處理組高70%左右，差異顯著，較ABA+D處理組高51%左右，差異顯著。

圖2 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of MT and ABA on the proline, soluble protein and soluble sugarcontent in kiwifruit seedling under drought stress

2.6 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片膜脂過氧化程度的影響

逆境會導致細胞膜的選擇透性降低或喪失，以致細胞內物質大量外滲，引起葉片浸出液電導率變化，因此相對電導率可反映膜受傷害程度[23]。單一或混合施用MT或ABA可降低相對電導率，緩解干旱引發的細胞膜傷害。如圖3A所示，MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的相對電導率分別較DCK處理組低7%、8%、18%左右(p>0.05)。丙二醛含量可衡量脂質氧化程度[24]，MT或MT和ABA的施用可降低幼苗葉片膜脂化程度，緩解干旱引發的細胞膜傷害。如圖3B所示，MT+D與MT+ABA+D處理組的MDA含量分別較DCK處理組低66%、44%左右，差異顯著。MT或ABA均可降低H2O2含量。如圖3C所示，MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的H2O2含量較DCK處理組低7%、13.5%、6.5%左右，差異顯著。

圖3 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對電導率、丙二醛(MDA)和H2O2含量的影響Fig.3 Effects of MT and ABA on the relative electrolytic leakage, MDA and H2O2 contentin kiwifruit seedling leaves under drought stress

2.7褪黑素和脫落酸處理對干旱脅迫下獼猴桃葉片抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)3種抗氧化酶的主要功能是去除活性氧自由基并防止其過度積累[25]，單一或混合施用MT和ABA對這3種抗氧化酶的作用效果各不相同。如圖4A所示，MT+D處理組的SOD活性較DCK處理組高134%左右，差異顯著。如圖4B所示，MT+D處理組的POD活性較DCK處理組低12%左右，差異顯著，而ABA+D與MT+ABA+D處理組的POD活性則分別較DCK處理組高41%與35.5%左右，差異顯著。但MT、ABA及MT+ABA均未對CAT活性產生明顯影響(圖4C)。

圖4 褪黑素與脫落酸對干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.4 Effect of MT and ABA on activity of SOD, POD and CATin kiwifruit seedling leaves under drought stress

3 討 論

土壤水分不足時，植物根系吸收的水分不足以彌補葉片蒸騰作用損失的水分，會導致葉片含水量降低，光合速率受限，生長受阻。單獨或混合施用外源激素MT和ABA可一定程度提高干旱脅迫下植物的葉片水勢與凈光合速率，改善獼猴桃幼苗在干旱脅迫狀態下生長的狀態。試驗表明，單獨施用MT可提高干旱環境中獼猴桃的葉片水勢與葉片相對含水量，這在其他植物的相關研究中鮮見報道，但有研究表明ABA可增加植株在干旱條件下的保水能力[26]。本試驗中ABA表現出了防止干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉綠素分解，增加凈光合速率與干物質積累的作用。值得注意的是，混合施用MT和ABA的作用與單獨施用ABA一致，但效果較單獨施用ABA顯著。推測，MT可激活ABA依賴型途徑中與保水相關的部分響應元件來提高植物的葉片水勢與葉片相對含水量，而同時施用MT與ABA，會導致植物ABA依賴型途徑中與光合和生長相關的響應元件較單獨施用ABA被更多或更強烈地激活，從而使得通過ABA依賴型途徑完成的干旱脅迫響應機制的作用效果更佳，但此推論尚待進一步研究和驗證。

研究表明，單獨施用外源MT和ABA可以提高植物的滲透調節物質含量[27-28]，該機制對植物適應干旱環境下的水分脅迫，維持正常生長與細胞吸水能力起到至關重要的作用[29-30]。試驗表明，對處于干旱環境中的植物單獨施用ABA可使植株中的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖3種滲透調節物質的含量較CK組有所升高，而單獨施用MT僅使可溶性蛋白含量較CK組有所提高。值得注意的是，混合施用MT和ABA的作用效果與單獨施用MT相似，作用效果不如單獨施用ABA顯著。推測，MT介導可溶性蛋白這一滲透調節物質激活ABA依賴型途徑響應元件，而同時施加MT與ABA，則降低了植物ABA依賴型途徑中與滲透相關的響應元件對ABA的敏感度，這或與MT升高了葉片水勢與葉片相對含水量，減緩了干旱導致的獼猴桃滲透脅迫強度有關。

干旱脅迫會導致植物活性氧自由基產生和清除的代謝平衡被破壞，引發或加劇細胞的膜脂過氧化，對植物細胞膜造成傷害[31-32]。本試驗中，單獨施用MT可降低植株的MDA含量與H2O2含量，而單獨施用ABA則只降低H2O2含量。二者聯合施用時，作用效果與單獨施用MT時相似，這是由于MT除可通過ABA依賴型途徑降低細胞膜脂過氧化程度外，還可直接參與活性氧自由基的清除，故其保護細胞膜的作用更為強大。這也與王云梅等[33]研究得出的MT與ABA組合處理具有與MT處理類似的緩解氧化損傷的效果的結論相一致。

相關研究表明，單獨施用MT和ABA可以提高抗氧化相關酶SOD、POD與CAT活性，減緩膜脂過氧化帶來的傷害[27-28,33]。本試驗中，單獨施用MT和ABA對SOD、POD活性的影響表現出了相反的作用，MT提高SOD活性，降低POD活性，而ABA則降低SOD活性，提高POD活性，但二者均未對CAT活性產生顯著影響。二者混合施用時的作用效果與單獨施用ABA類似。綜合來看，單一或混合施用MT和ABA對干旱脅迫下獼猴桃幼苗的抗氧化酶的活性變化的影響效果差異不大，SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶的活性始終處于一個相對平衡的狀態。

綜合來看，單獨施用MT利于增強干旱環境中獼猴桃的保水能力與抗氧化能力，關于MT提高植物抗氧化能力的報道較多，但關于其可提高保水能力的報道卻鮮見，有相關研究提及ABA可提高保水能力[26]。表明MT或可通過ABA依賴型途徑來增強植物的保水能力，這在前人相關研究中未見報道，其具體的作用機制仍有待進一步研究。而混合施用MT和ABA的作用效果與單獨施用ABA的效果類似，主要通過改善光合作用來實現干旱脅迫下的獼猴桃最優生長，這與王云梅等[33]在施用ABA濃度未表現出對葡萄干旱脅迫的緩解效果的情況下得出的 MT與ABA組合處理的效果與MT處理類似，主要通過緩解干旱引起的氧化損傷來提高抗旱性的結論不同，卻在一定程度上印證了MT可通過ABA依賴型途徑來完成干旱脅迫響應機制這一結論。MT與ABA兩者混合施用對植物脅迫的緩解效果及作用機理的研究鮮見報道，且大多與生理機制有關，并未深入到分子水平，MT與ABA組合處理的作用原理與機制仍存在大量空白，尚不清晰，有待進一步研究。

4 結 論

褪黑素(MT)可使干旱脅迫下獼猴桃的葉片相對含水量、葉片水勢和SOD活性分別提高9%、39%和134%左右，而MDA與H2O2含量降低66%與7%左右。ABA可提高葉綠素含量、凈光合速率、干物質積累和POD活性7%、40%、52%和41%左右，降低H2O2含量13.5%左右。MT+ABA處理的效果與ABA處理類似，可分別增加凈光合速率、干物質的積累量與POD活性29%、110%與35.5%左右，降低MDA與H2O2含量44%、6.5%左右。表明MT利于提高植株的保水能力，降低膜脂過氧化程度。ABA和MT+ABA處理利于提高光合作用，使植株在水分限制條件下積累更多干物質。