水稻表皮毛發(fā)育相關(guān)基因研究進(jìn)展

馮連杰 安文靜 劉迪 劉亞菲 王凱婕 梁衛(wèi)紅

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

表皮毛是廣泛分布于植物表面的一種特殊結(jié)構(gòu)，由表皮細(xì)胞分化形成［1］。作為植物表面與環(huán)境之間的屏障，表皮毛增加了植物組織表皮厚度，幫助植物減少水分流失、增強(qiáng)抗凍能力，具腺體的表皮毛還可通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物使植物獲得生化保護(hù)，從而增強(qiáng)植物的抗逆能力［2］。水稻葉片和穎殼表面普遍存在表皮毛，可分為長(zhǎng)毛、微毛和腺毛，長(zhǎng)毛主要分布在維管束的硅質(zhì)細(xì)胞上，而微毛和腺毛主要分布在氣孔或運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的周?chē)?］，還有專(zhuān)家將水稻表皮毛細(xì)分為長(zhǎng)毛、鉤毛、刺毛、纖細(xì)毛和鋸齒毛等類(lèi)型［4］，不同類(lèi)型的表皮毛在一定程度上反映了水稻品種與其生存環(huán)境的適應(yīng)關(guān)系。但具有表皮毛的毛葉水稻在收割晾曬過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量揚(yáng)塵，造成空氣污染的同時(shí)還易引起農(nóng)事人員眼睛及皮膚過(guò)敏、呼吸道感染等，危害身體健康，妨礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而缺乏表皮毛的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)光葉水稻的培育和推廣是解決這一問(wèn)題的有效途徑［5］。光葉稻作為一種重要的種質(zhì)資源，大多莖稈粗壯、具有較強(qiáng)抗倒伏能力，對(duì)高光強(qiáng)適應(yīng)性強(qiáng)、成穗率高、籽粒飽滿(mǎn)、米質(zhì)優(yōu)良，后代雜交優(yōu)勢(shì)明顯等特點(diǎn)［6］，尤其是因葉片、莖稈、葉鞘、穎殼等表面光滑無(wú)毛，不僅適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的機(jī)械化操作，而且可增加單位體積稻米的倉(cāng)儲(chǔ)量，提高運(yùn)輸效率，更適合現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)機(jī)械操作［7］。

與擬南芥相比，對(duì)水稻表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的挖掘目前仍然很有限，表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)很大程度上并不明確。由于表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的突變可導(dǎo)致水稻產(chǎn)生光葉表型，因此，水稻表皮毛相關(guān)基因的鑒定以及表皮毛發(fā)育機(jī)制的研究具有重要意義。近年來(lái)，一些水稻表皮毛相關(guān)基因相繼被鑒定或克隆，已有的研究結(jié)果顯示，水稻表皮毛發(fā)育與相關(guān)基因的表觀(guān)遺傳修飾［8-11］、啟動(dòng)子序列突變［12-14］、編碼蛋白質(zhì)序列變化［15-17］有關(guān)，此外還涉及細(xì)胞器功能異常［18-20］、激素信號(hào)通路變化［14］等多種途徑。本文總結(jié)了近年來(lái)水稻表皮毛相關(guān)基因及其功能的研究進(jìn)展、已知的水稻表皮毛發(fā)育調(diào)控途徑，并對(duì)水稻表皮毛發(fā)育相關(guān)基因研究的前景及應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 已知的表皮毛發(fā)育相關(guān)基因

現(xiàn)有的研究認(rèn)為，植物表皮毛相關(guān)的正負(fù)調(diào)控因子的平衡決定了表皮毛的發(fā)生［21］。在模式植物擬南芥中，已發(fā)現(xiàn)的正調(diào)控因子主要有GL1［22］、GL3［23-24］、EGL3［25］、TTG1［26］。GL1是最先被克隆的基因，編碼R2R3 MYB蛋白，在表皮毛發(fā)育初期特異表達(dá)，gl1突變體表現(xiàn)出表皮毛缺失或減少的表型［22］。GL3和EGL3編碼bHLH蛋白，gl3和egl3單突變體均表現(xiàn)為表皮毛減少，gl3 egl3雙突變體則表現(xiàn)為表皮毛缺失，表明GL3和EGL3存在功能冗余［23-25，27］。TTG1編碼WD40重復(fù)序列蛋白，該基因的強(qiáng)等位突變體ttg1表現(xiàn)為無(wú)毛，而弱等位突變體則表現(xiàn)為表皮毛簇生［26］。由于上述這些基因突變后擬南芥表皮毛減少或缺失，表明它們對(duì)表皮毛發(fā)育具有正調(diào)控作用。

擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的負(fù)調(diào)控因子主要有TRY［28］、CPC［29］、ETC1［30］和ETC2［30］，它們都屬于R3型MYB蛋白，其中TRY和CPC是主要的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)控?cái)M南芥葉片表皮毛的發(fā)育，try突變體表現(xiàn)為表皮毛簇生［28］；cpc突變體表皮毛數(shù)量增多［29］；ETC1和ETC2主要在莖表皮毛中起負(fù)調(diào)控作用，其中etc2突變體表皮毛增多，etc1突變體盡管沒(méi)有明顯的表型，但能增強(qiáng)CPC和TRY在表皮毛發(fā)育中的作用。當(dāng)同時(shí)突變TRY、CPC、ETC1和ETC2后，擬南芥表皮毛劇增［30］，表明這些基因?qū)Ρ砥っl(fā)生具有抑制作用。

關(guān)于擬南芥表皮毛發(fā)育機(jī)制，曾提出激活-抑制模型（the activator-inhibitor model）［31］和激活（底物）-消耗模型（the activator-substrate model）［32］，Balkunde［33］認(rèn)為目前的研究結(jié)果皆適用于上述兩個(gè)模型，即在擬南芥表皮毛發(fā)育過(guò)程中存在一個(gè)MBW復(fù)合體（GL1/ MYB23-GL3/EGL3-TTG1）來(lái)啟動(dòng)表皮毛的發(fā)育，該復(fù)合體還負(fù)責(zé)調(diào)控TRY、CPC、ETC1和ETC2等負(fù)調(diào)控因子轉(zhuǎn)移至相鄰的非表皮細(xì)胞，并與GL1競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合GL3，使相鄰細(xì)胞由于GL3缺失而導(dǎo)致MBW復(fù)合體的含量降低，從而抑制表皮毛的發(fā)生［33-34］。隨著表皮毛發(fā)育研究的不斷深入，上述模型相繼得到拓展。從組蛋白修飾方面進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5通過(guò)組蛋白乙酰化修飾，上調(diào)GL1、GL2、GL3和CPC的表達(dá)水平，從而促進(jìn)了表皮毛的形成［35］。最近，Huang等［36］的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶JmjC家族成員JMJ29可以直接結(jié)合在GL3基因的啟動(dòng)子上，激活該基因的表達(dá)，同時(shí)JMJ29還間接調(diào)控了GL1和GL2基因的表達(dá)，最終促進(jìn)了表皮毛的發(fā)育。同時(shí)，mRNA穩(wěn)定性調(diào)控方面的研究也取得重要進(jìn)展，如Wei等［37］發(fā)現(xiàn)表皮毛發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性維持和轉(zhuǎn)錄因子ETC2相關(guān)，ECT2可結(jié)合于mRNA上的m6A（N6-methyladenosine）修飾位點(diǎn)，不僅在核內(nèi)參與其3′UTR的加工，而且調(diào)節(jié)mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，敲除ECT2后，加速了表皮毛發(fā)育相關(guān)基因TTG1，ITB1和DIS2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解，從而影響表皮毛的分枝。最近的研究還發(fā)現(xiàn)GL1基因3′端UTR區(qū)的一段153 bp的序列可能通過(guò)影響其mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激活特性，在表皮毛形成過(guò)程中具有重要作用［38］。一些研究還發(fā)現(xiàn)表皮毛發(fā)育過(guò)程涉及蛋白質(zhì)降解的調(diào)控，如E3泛素蛋白連接酶UPL3可通過(guò)促進(jìn)GL3和EGL3的降解，抑制表皮毛的形成［39］。另有一些研究將轉(zhuǎn)錄因子和激素信號(hào)之間的聯(lián)系建立起來(lái)，如RAV家族轉(zhuǎn)錄因子TEM1和TEM2通過(guò)控制赤霉素（GA）在葉肉細(xì)胞中的累積，抑制表皮毛發(fā)育的起始，且TEM2的抑制作用強(qiáng)于TEM1［40］。上述研究表明，組蛋白修飾、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控、蛋白質(zhì)降解過(guò)程以及轉(zhuǎn)錄因子、植物激素都可以通過(guò)調(diào)節(jié)表皮毛發(fā)育正負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控MBW復(fù)合體的構(gòu)建以及在細(xì)胞中的含量，從而指導(dǎo)擬南芥表皮毛的形成。盡管現(xiàn)有研究已經(jīng)建立了擬南芥表皮毛發(fā)育的核心模型，但具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚［41］。

與擬南芥相比，目前對(duì)水稻表皮毛的研究還有待深入，分離鑒定的相關(guān)基因或QTL僅涉及表皮毛發(fā)育的正向調(diào)控過(guò)程。已知的相關(guān)基因主要有OsWOX3B（GLR1、NUDA/ GL-1/dep、GL5）［8-11］、GL6（HL6）［12-14］、glr2［15］、GLR3（OsSPL10）［16-17］、gl1［18-19］、GLL［20］等（表1），這些基因的突變往往導(dǎo)致水稻葉片與穎殼表皮毛減少或缺失。

表1 水稻表皮毛發(fā)育已知基因Table 1 Known genes for rice trichomes development

最早被關(guān)注的水稻光葉基因是OsWOX3B/GLR1/NUDA/GL-1/dep/GL5，該基因的報(bào)道分別來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的獨(dú)立研究，其中Li等［8］利用美國(guó)水稻品種Rico No. 1和光葉水稻品種Jia64構(gòu)建了光葉稻的近等基因系（NIL），將光葉基因GLR1精細(xì)定位在5號(hào)染色體標(biāo)記M6與M7之間的21 kb內(nèi)，對(duì)GLR1進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，減弱GLR1表達(dá)量可導(dǎo)致表皮毛數(shù)量顯著減少或完全消失，并且在敲除株系NILglr1中組成型表達(dá)GLR1能夠彌補(bǔ)T0代NILglr1的無(wú)毛表型［8-9］。Zhang等［10］對(duì)另一個(gè)光葉基因NUDA/GL-1的研究顯示，光葉性狀受該基因隱性遺傳控制，NUDA/GL-1與WUSCHEL-like基因OsWOX3B同源，但OsWOX3B基因在具毛水稻品種TN1和光葉稻品種HMK中并沒(méi)有DNA水平的差異，因而推測(cè)NUDA/GL-1產(chǎn)生的無(wú)毛表型可能由表觀(guān)遺傳修飾引起［10］。Angeles-Shim等［11］也發(fā)現(xiàn)了該光葉基因并將其命名為dep，其編碼蛋白WOX 3B定位于細(xì)胞核中，然而對(duì)無(wú)毛品種與具毛品種的dep序列比較并未發(fā)現(xiàn)差異，提示控制光葉性狀的dep基因可能也涉及表觀(guān)遺傳修飾作用的調(diào)節(jié)。但是究竟是何種表觀(guān)遺傳修飾在控制OsWOX3B/GLR1/ NUDA/GL-1/dep/GL5的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。

光葉基因HL6/GL6編碼含AP2保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，對(duì)該基因的研究也來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道，其中Sun等通過(guò)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明HL6以劑量依賴(lài)性調(diào)節(jié)長(zhǎng)毛的生長(zhǎng)，HL6過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致水稻葉片表皮毛更長(zhǎng)，并推測(cè)HL6的啟動(dòng)子序列變異可能是ZS97與W39水稻分別產(chǎn)生無(wú)毛和多毛表型的原因［12］。Zeng等將GL6定位在6號(hào)染色體，其編碼蛋白GL6位于細(xì)胞核內(nèi)，GL6可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶OSK3或COP9復(fù)合體（CSN）的亞基CSN5相互作用［13-14］，盡管OSK3功能尚不明確，但已知COP9信號(hào)體復(fù)合體在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞周期等方面都發(fā)揮著重要作用［42］，提示GL6蛋白可能在細(xì)胞核中與CSN5結(jié)合，參與形成CSN復(fù)合物，調(diào)節(jié)表皮毛發(fā)育進(jìn)程。

基于光葉水稻突變體glr2的研究，Wang等［15］將突變基因定位于1號(hào)染色體的84.7 kb區(qū)間，并對(duì)其間的12個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)分析，結(jié)果顯示Loc_Os01g70100、Loc_ Os01g70080和Loc_Os01g70110在野生型與突變體中表達(dá)水平存在較大差異，其中Loc_Os01g70100編碼一個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子。由于已知在擬南芥中有4種鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GIS1，GIS2，ZFP5，ZFP8）與表皮毛發(fā)生有關(guān)［43-44］，因而推測(cè)Loc_Os01g70100可能與水稻的光葉表型有關(guān)。

在秈稻品種R401輻射誘變過(guò)程中篩選到一個(gè)光葉突變體glr3［16］，該突變體表現(xiàn)為葉片無(wú)毛且邊緣無(wú)鉤毛、穎殼無(wú)毛，該性狀受定位于6號(hào)染色體上的隱性基因GLR3控制，GLR3屬于SBP-box基因家族成員，與OsSPL10為同一個(gè)基因。Lan等［17］分別構(gòu)建了OsSPL10的突變體與過(guò)表達(dá)水稻發(fā)現(xiàn)，OsSPL10功能喪失導(dǎo)致了水稻葉片與穎殼無(wú)毛，以及更高的耐鹽性，而過(guò)表達(dá)的OsSPL10則導(dǎo)致水稻表皮毛密度高于野生型，且對(duì)鹽具有高敏感性，據(jù)此推測(cè)OsSPL10可能是控制表皮毛發(fā)育起始過(guò)程中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

光葉基因gl1-1也是來(lái)自輻射誘變水稻品種93-11制備的光葉突變體，該基因定位于5號(hào)染色體，序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與野生型序列相比，gl1-1基因的序列僅在Os05g0118900（Loc_Os05g02754）的5′UTR區(qū)存在一個(gè)A→T的點(diǎn)突變，這一突變引起了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，導(dǎo)致該突變體表現(xiàn)出穎殼無(wú)毛、葉片無(wú)宏毛和微毛的表型［18-19］。王啟釗［45］等進(jìn)一步證明gl1-1編碼一個(gè)葉綠體跨膜蛋白，但迄今該基因與表皮毛發(fā)育之間的聯(lián)系尚未闡明。

還有一些光葉基因的分離來(lái)自T-DNA標(biāo)簽技術(shù)制備的光葉突變體，如定位在6號(hào)染色體上的GLL基因［20］，GLL主要在細(xì)胞核中表達(dá)，屬于PEX11基因家族成員。已知PEX11家族編碼過(guò)氧化物酶體蛋白，而植物中過(guò)氧化物酶體是極長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化的唯一場(chǎng)所［46］，所以該基因可能與脂類(lèi)代謝相關(guān)。有研究顯示，與長(zhǎng)鏈脂肪酸相關(guān)基因的異常表達(dá)可提高細(xì)胞內(nèi)極長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量，從而導(dǎo)致葉表皮毛細(xì)胞的程序性死亡［47］，據(jù)此推測(cè)GLL可能通過(guò)參與極長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝過(guò)程，影響葉片表皮細(xì)胞的分化，并最終決定表皮毛的存亡。

2 水稻表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制

水稻表皮毛的發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，盡管一些水稻表皮毛相關(guān)基因陸續(xù)得到定位與克隆，但水稻表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制很大程度上仍是未知的。對(duì)水稻光葉基因的研究顯示，表觀(guān)遺傳修飾作用于一些基因可導(dǎo)致光葉表型，如OsWOX3B/GLR1/NUDA/GL-1/dep/ GL5［8-11］；一些基因表達(dá)水平的改變也可導(dǎo)致光葉表型，如GL6/HL6［12-14］；多種轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的突變也可以導(dǎo)致光葉表型，如編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因glr2［15］和SBP蛋白編碼基因GLR3（OsSPL10）［16-17］。此外，一些細(xì)胞器相關(guān)基因突變也會(huì)導(dǎo)致光葉表型，如編碼葉綠體跨膜蛋白的基因gl1［18-19］和編碼過(guò)氧化物酶體蛋白的基因GLL［20］。與擬南芥類(lèi)似的是，在水稻中也發(fā)現(xiàn)植物激素涉及表皮毛的發(fā)育，目前已知的是生長(zhǎng)素信號(hào)與表皮毛發(fā)育相關(guān)，如HL6通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)素相關(guān)基因OsYUCCA5、OsPIN1a、OsARF4、OsARF7和OsIAA21的表達(dá)，促進(jìn)表皮毛的伸長(zhǎng)，并通過(guò)與OsWOX3B物理結(jié)合加強(qiáng)這一促進(jìn)效應(yīng)［14］（圖1）。

圖1 水稻光葉表型獲得的主要途徑Fig. 1 Main pathways to obtain glabrous leaf phenotype in rice

在擬南芥中，除多種表皮毛發(fā)育正向和負(fù)向調(diào)節(jié)因子外，表皮毛的發(fā)育還受細(xì)胞周期調(diào)控因子和赤霉素、茉莉酸等多種植物激素的影響［48-51］，為水稻表皮毛發(fā)育機(jī)制的研究提供了借鑒和參考。值得關(guān)注的是，現(xiàn)有的研究顯示單子葉植物與雙子葉植物的表皮毛調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也存在一定的差異，如水稻OsTCL1與擬南芥AtTCL1屬于同源基因，AtTCL1過(guò)表達(dá)擬南芥的表皮毛形成被抑制，但是OsTCL1過(guò)表達(dá)水稻與對(duì)照水稻相比，表皮毛并沒(méi)有出現(xiàn)明顯差異［52］。

3 總結(jié)與展望

目前對(duì)水稻光葉基因的研究多以光葉突變體為材料，通過(guò)經(jīng)典的圖位克隆確定相關(guān)QTL，進(jìn)一步分離突變基因，并采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定基因在表皮毛發(fā)育中的功能。擬南芥中，激活-抑制模型和激活（底物）-消耗模型得到越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果印 證，在水稻中是否也存在類(lèi)似的模型來(lái)解釋表皮細(xì)胞分化的命運(yùn)，并指導(dǎo)水稻表皮毛的形成尚不清楚，因此有必要對(duì)水稻表皮毛發(fā)育相關(guān)基因開(kāi)展更為系統(tǒng)深入的研究，闡明水稻表皮毛發(fā)育的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析光葉表型形成的分子基礎(chǔ)，為光葉稻的育種奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)掘新的水稻光葉相關(guān)基因，并將已知的水稻光葉基因運(yùn)用到光葉稻育種中進(jìn)行高效、精準(zhǔn)的改良具有重要意義，同時(shí)也富有挑戰(zhàn)性。隨著CRISPR/Cas9基因編輯等技術(shù)的發(fā)展，水稻功能基因鑒定和應(yīng)用的步伐加快，如Wang等［53］以秈粳雜交稻春優(yōu)84作為水稻無(wú)融合生殖研究的模式品種，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了其中的REC8，PAIR1，OSD1 和 MTL4個(gè)水稻生殖相關(guān)基因，建立了水稻無(wú)融合生殖體系，成功克隆出雜交稻種子，首次實(shí)現(xiàn)雜交稻性狀穩(wěn)定遺傳到下一代，不僅證明了雜交稻進(jìn)行無(wú)融合生殖的可行性，而且證明了CRISPR/ Cas9技術(shù)在水稻高效精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種中的重大理論意義以及廣闊的應(yīng)用前景。近期本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了OsRhoGAP2基因編輯水稻，其中一個(gè)純和株系就出現(xiàn)光葉表型［54］。現(xiàn)有的報(bào)道顯示，水稻光葉突變體表型復(fù)雜多樣，同一光葉稻基因不僅可以控制表皮毛的發(fā)育，還可控制表皮毛的種類(lèi)；相同的等位基因在不同的遺傳背景下，也可導(dǎo)致水稻產(chǎn)生的不同的光葉表型，因此分離鑒定光葉表型相關(guān)基因，深入剖解其作用機(jī)制，將有助于充分利用基因資源開(kāi)展分子設(shè)計(jì)育種，創(chuàng)制新的光葉水稻品種，服務(wù)生產(chǎn)。