基于信號肽策略提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達

苗華彪 曹艷 楊夢瀚 黃遵錫

（1. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2. 生物能源持續開發利用教育部工程中心，昆明 650500）

與大腸桿菌和酵母菌相比，枯草芽孢桿菌表達系統研究起步較晚，但因其具有：安全、蛋白分泌能力強、易于高密度發酵、遺傳背景清晰和被認為是安全菌株（generally recognized as safe，GRAS）等優勢，使其成為基因表達系統研究熱點之一［1-3］。枯草芽孢桿菌作為表達宿主菌可以將蛋白分泌到胞外培養基中，這一過程由位于外源蛋白N末端的信號肽來完成，它可以正確的將外源蛋白導向分泌裝置，在蛋白分泌過程中起著不可替代的作用［2，4］。目前，只有少數外源蛋白在枯草芽孢桿菌表達系統中實現了高效表達，但還有大多數外源蛋白的分泌和表達效果不理想。其中枯草芽孢桿菌信號肽的氨基酸組成、類型和分泌途徑均會對外源蛋白分泌的效率產生影響，合適的信號肽是保證外源蛋白在枯草芽孢桿菌高效表達的關鍵因素之一。基于信號肽的策略提高外源蛋白的分泌量是切實可行的，并且往往會取得意想不到的效果［5-6］。雖然科學家們對枯草芽孢桿菌信號肽進行了堅持不懈的探究，但仍然存在許多尚未解決的問題。本文綜述了枯草芽孢桿菌信號肽的最新研究進展，重點討論了一般分泌途徑（general secretion pathway，Sec）和雙精氨酸分泌途徑（twin-arginine traslocation pathway，Tat）信號肽的結構特點、分類、分泌機制及其在提高外源蛋白表達方面的實際應用。同時總結了信號肽在枯草芽孢桿菌表達系統中應用的問題和展望，以期為通過信號肽的策略提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達提供一定的參考。

1 信號肽的概述

四十多年前蛋白質合成后的轉移與定位是不為人知的，直到1975年Blobel等［7］正式提出信號假說（signal hypothesis）后，才得以解決。其認為游離核糖體是開始合成分泌蛋白的場所，新合成的蛋白質有一個內源性的信號肽，可以與內質網膜識別并結合，緊隨其后的新生肽鏈則不斷延伸并通過內質網膜，合成完成后信號肽則被信號肽酶（signal peptidase，SPase）水解［7］，此后，信號識別顆粒（signal recognition protein，SRP）及其受體（SRP receptor，SR）的發現完善了該假說［8-9］。隨后大量的研究表明信號肽的作用機理普遍存在于動植物和微生物中，進而使其成為一個系統的理論，Blobel也因此獲得了1999年的諾貝爾生理學或醫學獎［4］。信號肽的提出為研究蛋白質的空間屬性這一新領域開辟了道路，也為研究蛋白質的結構和功能奠定了基礎［7-9］。

2 枯草芽孢桿菌信號肽分泌途徑

由于枯草芽孢桿菌缺乏外膜結構，分泌蛋白會轉運到胞外培養基中，保證分泌蛋白的正確定位和轉移則由信號肽來完成［2］。枯草芽孢桿菌可以將300多種蛋白分泌到胞外［2-4］，至少包含4種類型的蛋白分泌途徑，分別為：Sec分泌途徑、Tat分泌途徑、假菌絲蛋白輸出途徑（Pseudophilin pathway，Com）和ATP結合盒轉運子途徑（ATP-binding cassette transporter，ABC）［4］。其中Sec和Tat分泌途徑的信號肽占整個枯草芽孢桿菌的90%以上，為此將重點討論這兩種分泌途徑的信號肽。

2.1 Sec分泌途徑

2.1.1 Sec分泌途徑信號肽的類型 Sec分泌途徑是枯草芽孢桿菌最主要的分泌途徑，主要轉運未折疊的蛋白質。由于信號肽預測軟件的算法不同，對信號肽的分類也會存在一定的差異。通常根據SPase切割底物特異性不同可分為兩類：I型信號肽，是由I型信號肽酶（Lep）進行切割的信號 肽［4，10-11］，Tjalsma等［10］總結了這種信號肽有166種，Brockmeier等［12］總結了173種；II型信號肽，是由II型信號肽酶（LspA）進行切割的一類脂蛋白信號肽［11，13］，據 Tjalsma等［11］報道有114種。隨著對枯草芽孢桿菌信號肽的不斷研究，目前可在信號肽數據庫（http：//www.signalpeptide.de/index.php）中查詢到的枯草芽孢桿菌來源的信號肽已有244種，在Tjalsma等［11］報道的基礎上新增了61種。

2.1.2 Sec分泌途徑信號肽的結構 對Sec分泌途徑的信號肽基本性質進行統計，發現I型信號肽長度在17-45 aa之間，平均長度接近28 aa；II型信號 肽 更 短（13-38 aa），平 均 長 度 不 足20 aa（圖 1-A）［4-5，11］。雖然信號肽的一級結構之間沒有直接相關性，但其二級結構還是有一定的規律可循。利 用SignalP 3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）和Phobius（http：//phobius.sbc.su.se/）信號肽預測網站可將信號肽分為3段不同的結構域：（1）N端結構域，通常含有1-5個帶正電的氨基酸殘基（R/K），這可能與轉運過程中膜脂質雙層中帶負電荷的磷脂相互作用有關［11］。（2）H端結構域，是由7-15個疏水性氨基酸組成的螺旋結構，這種結構有利于信號肽插入膜中，有助于特定SPase的切割［2-3，11］，而且H端結構域疏水性氨基酸占比高達80%左右，其中甘氨酸（G）、脯氨酸（P）、亮氨酸（L）和纈氨酸（V）出現頻率最高［4，11］。（3）C端結構域位于信號肽的最末端，包含SPase切割位點，將信號肽從成熟蛋白上切割下來，成熟蛋白則可折疊成天然構象，信號肽則被移除和降解。通常，Lep信號肽的SPase識別位點是AXAA，LspA信號肽是LAAC，它與其他分泌型蛋白信號肽最大差異在于具有一個不變的半胱氨酸（C）殘基，有助于脂蛋白的切割和錨定［4-5，11，14］。信號肽能夠有效地被SPase識別并剪切的前提條件是C端必須具有一個β片狀折疊延伸結構，且C端-2位的氨基酸殘基通常具有體積小且無電荷的特點［4］。

2.1.3 Sec途徑信號肽的分泌機制 Sec分泌途徑一般分為4步完成（圖1-B）：（1）識別：首先，在核糖體上轉錄翻譯后的基因，生成一條N端帶有一段信號肽的多肽鏈，由SRP來完成對該多肽鏈的識別，并被膜受體（FtsY）引導至轉運子［14］。其中，SRP是一個高度保守的蛋白-核酸復合物，它包括一個細胞質小RNA（scRNA）［15］、兩個組蛋白類似物（HBsu）［16］和一個獨立蛋白（Ffh）組成［11，16］。（2）易位：前體蛋白主要通過Sec轉運酶完成跨膜，它由轉運通道（SecYEG）［17］、馬達蛋白（SecA）［17-18］和輔助蛋白（SecDF-YrbF）3部分組成［19-20］。其中，SecYEG蛋白是由SecY、SecE和SecG三個單體蛋白形成的膜結合異源三聚體，在蛋白轉移中起輔助通道作用，只與蛋白分泌的效率有關［17］。Sec轉運酶的能量來源是由馬達組件SecA催化ATP的水解來提供，多數情況下SecA是以單體的形式存在，但SecA也存在其他的寡聚體結構形式來發揮同樣的功能［21-22］。此外，SecA也可充當伴侶分子，直接將底物從合成位點轉運到轉運酶上，但這種僅由SecA構成的通道效率較低［21-22］。SecDF與同系物YrbF構成一個異源三聚體的輔助蛋白［23］，作用是將前體蛋白從通道中提取出來［2-3］，但某些前體蛋白（PhoB和YvaY）的分泌，需要另外一個同型二聚體輔助蛋白CsaA的參與［24］。（3）切除：前體蛋白跨膜轉運后，位于N末端的信號肽需要被切除，否則，可能會影響到其他蛋白的易位，信號肽序列的切割是由膜結合蛋白SPase來完成，切除下來的信號肽不會一直存在，由SppA和TepA將其降解［2-4］。枯草芽孢桿菌染色體上存在多種SPase基因，多數情況下，1-2個基因的表達足以滿足前體蛋白的加工和細胞活力［2-4］，這種基因多樣性保證了不同條件下蛋白分泌的靈活性。此外，SPase不僅具有切割功能，也參與枯草芽孢桿菌的產孢和貼壁生物膜的形成等生理反應［11，25］。（4）加工后修飾：轉運蛋白的修飾、折疊和后續過程都會受到一些特定分子伴侶的影響。枯草芽孢桿菌具有細胞內和細胞外兩種分子伴侶以單獨或協同作用的方式加快蛋白質的折疊和組裝，可以協助轉運蛋白的聚集和維持轉運前體蛋白的構象［21，26-28］。如脂蛋白（PrsA）屬于細胞外伴侶，可促進成熟蛋白的折疊、穩定正確的蛋白構象［25］。分泌到膜外的蛋白，如果發生了錯誤折疊則由蛋白酶類進行降解。

2.2 Tat分泌途徑

2.2.1 Tat分泌途徑信號肽的類型和結構特點 Tat類信號肽作為枯草芽孢桿菌第二大分泌途徑，數量少了很多［4，11，32］，一般認為有24種這樣的信號肽，其中有14種能被Lep信號肽酶所識別［11］。該類信號肽長度要明顯大于Sec途徑信號肽，N端結構域的長度是Sec途徑信號肽的兩倍，在N端和H端的連接處具有一個明顯的保守序列++RR## （圖1-C）［4-5，11］；H端相比于Sec途徑信號肽長度更長且疏水性要低［11］；C端出現頻率較高的氨基酸殘基也和Sec途徑信號肽不同［4-5，11］。

2.2.2 Tat途徑信號肽的分泌機制 Tat分泌途徑信號肽轉運那些折疊迅速或已經在胞內折疊好的蛋白質［29-31］，這些蛋白利用Sec分泌途徑信號肽很難轉運（圖1-D）。與Sec分泌途徑不同的是，目前，僅鑒定出PhoD、YwnN、QcrA和YkuE這4種底物蛋白是明確按照Tat途徑進行分泌［29-31，33-36］。Tat系統可以處理高達150 kD的前體蛋白，但Tat途徑中的各組件都比較小，這意味著它們需要組裝成較大的復合物，以促進較大前體蛋白的跨膜通過［29，37］。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌Tat分泌途徑擁有兩套相互獨立的通道蛋白復合物：由tatAdCd操作子所編碼的TatA（230 kD）通道蛋白，它由在膜上成“ L形”排列的TatAd（7.4 kD）蛋白和具有6個跨膜螺旋的TatCd（28 kD）蛋白復合組成；及由tatAyCy操作子所編碼的TatC（200 kD）通道蛋白，它由TatAy（6 kD）和TatCy（28.9 kD）兩種蛋白組成；底物蛋白的易位，還需要枯草芽孢桿菌TatAc（6.7 kD）蛋白的幫助［37-38］。進行蛋白分泌時，首先轉運酶復合物通過兩親性雙螺旋結構形成一個比Sec途徑孔道要大的直徑為5-6 nm的跨膜Tat孔空結構，這也許是已折疊蛋白能夠穿過該通道的一個重要原因［29-30］。之后，前體蛋白先與TatA/TatC相連的復合物相互作用，在跨膜pH梯度下，將折疊好的前體蛋白轉移到Tat孔外［31］，易位后，I型SPase裂解信號肽，成熟的蛋白質分泌到培養基中［29-31］。另外，Walther等［39］基于電區域（DCR）和兩親性螺旋（APH）的互補性，也提出了Tat分泌途徑一種可能機制：這種Tat分泌途徑的蛋白質被7個鹽橋“拉鏈”，形成了一個易于穿過脂質雙層的發夾結構。Tat途徑已成為一種日益流行的運輸途徑，因為它將目標蛋白全折疊分泌到培養基中，從而降低了純化成本，在生物技術應用方面的研究也越來越受到重視。

圖1 枯草芽孢桿菌Sec和Tat分泌途徑信號肽的主要特征和機制示意圖（依據參考文獻［2，5，21，27，29-31］繪制）Fig .1 Schematic diagram of the main characteristics and mechanism of the signal peptides about the secretory pathways of Bacillus subtilis Sec and Tat（Based on the references［2，5，21，27，29-31］）

3 信號肽在提高外源蛋白分泌表達中的應用

3.1 基于對信號肽的直接替換提高外源蛋白的 表達

目前，對信號肽的應用仍然處于探索階段，由于對分泌機制了解有限，準確預算出一個蛋白的最佳信號肽還較為困難。雖然研究人員開發了有助于信號肽選擇的預測工具，但評分和蛋白實際分泌量似乎不相關［12］。為了提高外源蛋白的表達量，學者們開始嘗試直接在外源蛋白的N端添加或者替換原有信號肽，詳見表1。雖然這種方式工作量較大，且存在一定的隨機性，但近年來在提高外源蛋白表達量方面也取得了一定成果，實現了酰胺酶［40］、氨肽酶［41］、堿性絲氨酸蛋白酶［42］、角蛋白酶［43］、L-天冬酰胺酶［44］、β-甘露聚糖酶［45］、堿性果膠酶［46］、果聚糖蔗糖酶［47］、普魯蘭酶［48］、聚對苯二甲酸乙二醇酯水解酶［49］、脂肪酶［50］、β-半乳糖苷酶［51］和淀粉酶［52-56］胞外表達量的提高。通常借鑒被認為能夠高效分泌外源蛋白的常用信號肽，如Sec分 泌 途 徑 的AmyE［40-42，44，47-49，51-52，55-56］、 AprE［42，46，51-52，55］、NprE［41-43，45，47-48，51-54，56］、NprB［40，42，45，50，54］、SacB［40-42，47-49，52，54，56］和Bpr［41-42，46-47，49，53-55］等外源蛋白的信號肽；Tat分泌途徑的PhoD［［42，45，49，51，54，56］、YwbN［42-46，49，51，53］、 LipA［40，42-45，50，54，56］、WapA［42-44，46-47，52-53］等外源蛋白的信號肽，構建幾個乃至幾十個含有不同信號肽的異源表達載體，分別將其導入枯草芽孢桿菌中，并進行外源蛋白分泌量的比較，進而確定哪種信號肽適合外源蛋白的表達。這種方式篩選到的高表達信號肽，由于篩選范圍的狹小，未必就是這種外源蛋白分泌最佳信號肽。有趣的是，我們無法確定哪種類型的信號肽比較適合外源蛋白的分泌表達，甚至，同一類外源蛋白（淀粉酶）由于基因和性質上的差異，導致所篩選的高效表達信號肽也不同［52-56］。雖然Tat分泌途徑的信號肽只有24種，但在提高外源蛋白表達方面，似乎概率性更高［43-45，49-51，53］。

表1 基于對信號肽的直接替換提高外源蛋白表達的研究Table 1 Research on improving the expression of foreign proteins based on direct replacement of signal peptides

3.2 基于對信號肽的突變提高外源蛋白的表達

有報道顯示枯草芽孢桿菌信號肽N端帶正電荷氨基酸數量和H端疏水性強弱對外源蛋白的分泌有一定影響［2-4］，通過對信號肽的突變也能提高外源蛋白的表達量，見表2。一般采用3種方式改造信號肽的N端區域：將原有氨基酸突變成堿性氨基酸（K/R）［50，53，57］；在N端直接插入堿性氨基酸 （K/R）［53］和將原有氨基酸進行飽和突變［50，58］。通過對信號肽的N端區域進行改造實現了脂肪酶［50］、淀粉酶［53，55］、地衣聚糖酶［57］和角質酶［58］表達量的提高。此外，也會采用N端和H端相結合的方式提高信號肽的分泌能力，如Fu等［57］和馬櫻芳等［53］在增加N端正電荷數量基礎上，進一步將H端的極性氨基酸突變成非極性氨基酸，從而降低H端的疏水性，實現了提高淀粉酶［53］和地衣聚糖酶［57］的胞外酶活。此外，祝發明等［59］針對信號肽AmyX三個區域的同時突變使β-半乳糖苷酶胞外酶活提高了2.5倍。研究也發現信號肽N端所含正電荷數量也不是越多越好，Fu等［57］在對信號肽H1進行突變時發現，當N端有4個正電荷的堿性氨基酸時，其分泌能力反而大幅度降低，這與周勇［50］、袁林等［55］和馬櫻芳等［53］對信號肽N端區域突變時所得結論一致。Caspers等［58］在對信號肽（AmyE）N端區域進行飽和突變時，突變體F2D和F2E雖然導致信號肽N端正電荷數量減少，但角質酶胞外酶活卻提高了約3倍，也佐證了這一觀點。綜上，通過對信號肽N端和H端的氨基酸殘基進行適當的突變和插入，改變信號肽N端區域的帶正電數［50，53，55，57-58］和降低H端的疏水性［50，57］，進一步改變了信號肽二級結構和前體蛋白折疊方式，從而提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌能力［2-4，58］。綜合前人［57-58］的研究結果可知信號肽N端的正電荷數量+2或+3比較合適，具體原因有待進一步探究。通過這種方式，較構建信號肽文庫大大減少了工作量，相對于直接替換其他類型信號肽，也增加了準確性，作者認為這種方式將是未來對信號肽改造的一個熱門趨勢。

表2 基于對信號肽的突變提高外源蛋白表達的研究Table 2 Research on improving the expression of foreign protein based on mutation of signal peptide

3.3 基于構建信號肽文庫提高外源蛋白的表達

為了構建優化異源蛋白分泌的有力策略，Brocmeier等［12］構建了一個信號肽庫，結合高通量篩選的方法，可以篩選到分泌異源蛋白的最佳信號肽，這是目前應用最為廣泛且成功的方式，見表3。其步驟總結如下：首先，通過PCR的方式從B. subtilis 168［12，60-65］或B. subtilis 1A427［63］基因組上擴增出173種Sec信號肽目的片段，混合成一個信號肽雜合文庫，即使商業化的文庫［60，63-64］也是采用這種方式獲得；同時，構建一個包含外源蛋白的表達載體骨架，研究表明，信號肽和外源蛋白之間多余的氨基酸（酶切位點），似乎并不影響外源蛋白的分 泌［12，60，66］，也可采用融合PCR的方式避免這一問題［65］。其次，通過酶切或PCR的方式將包含外源蛋白的載體骨架線性化，借助于無縫克隆［62-66］進行信號肽文庫的構建，這就需要在PCR擴增信號肽片段時在兩端預留20 bp用于與載體重組的序列。由于枯草芽孢桿菌的轉化效率不如大腸桿菌，構建好的信號肽文庫質粒導入枯草芽孢桿菌之前，通常會選擇一個大腸桿菌亞文庫來介導［12，60，66］，這就要求表達載體必然是一個穿梭質粒，至今，只有Fu等［65］實現了將構建好的信號肽文庫質粒直接導入枯草芽孢桿菌中。對于信號肽混合質粒導入枯草芽孢桿菌的方式有spizizen法［12，60，62，64-65］、原生質體法［61］和電轉化法［63，66］。最后，信號肽文庫的篩選，通常結合高通量篩選技術［12，60-61，63，65］或與透明 圈［61，65］一起進行篩選。Tsuji等［62］也報道了直接采用透明圈的方式進行篩選；Zhang等［66］則利用針對每一個信號肽，從構建到篩選均是一一對應，直接比較每一個胞外木聚糖酶活性的方式進行篩選。目前已完成了角質酶［12］、細胞質酯酶［12］、α-麥芽淀粉酶［60］、蛋白酶［61］、植酸酶［62］、α-淀粉酶［63-65］和木聚糖酶［66］的最佳信號肽的篩選。本課題組也對來自解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶最佳信號肽進行了篩選，使其胞外淀粉酶活力提高了3.8倍［63］。由于每一種外源蛋白在枯草芽孢桿菌的分泌方式均不同，構建多種混合信號肽文庫的方法雖然復雜且工作量和篩選任務繁重，但能夠獲得一個真實的外源蛋白分泌最佳信號肽。此外，也有學者報道了利用枯草芽孢桿菌信號肽文庫在Escherichia coli［67-69］、Corynebacterium glutamicum［70］和Baclicus lincheniformis［61］宿主菌中實現提高外源蛋白表達量的應用。

表3 基于構建信號肽文庫提高外源蛋白表達的研究Table 3 Research on improving foreign protein expression based on constructing signal peptide library

3.4 基于信號肽中稀有密碼子提高外源蛋白的 表達

目前關于外源蛋白基因密碼子偏好性的研究主要集中在大腸桿菌和釀酒酵母5′端信號肽區域［71］。研究表明，大腸桿菌中信號肽的第二個氨基酸更偏好能保證高起始翻譯的賴氨酸（L）密碼子是AAA而不是AAG［72-73］；革蘭氏陽性菌Streptomyces coelicolor［74］同樣也發現稀有密碼子在信號肽序列中的高頻率使用，甚至信號肽區域使用稀有密碼子獲得的蛋白質產物是使用普通密碼子的數倍［75-76］。通過分析其蛋白質產物二級結構發現信號肽使用不同密碼子得到的蛋白質二級結構有顯著的差異，可能是由于使用通用密碼子時蛋白質翻譯速度過快，信號肽序列區域的構象和正常情況不同，導致后續成熟蛋白的折疊也出現錯誤而被降解［77］。信號肽區域的稀有密碼子對保證正確的共翻譯折疊具有重要作用［71］。因此，可在分泌蛋白基因5′端信號肽區域使用tRNA適應指數（tRNA adaptation index，tAI）值低的密碼子減慢翻譯速度以幫助蛋白質的跨膜、加工成熟和折疊［78］。此外，在SRP結合位點下游大約35-40個密碼子的區域內存在較多的稀有密碼子，通過減緩翻譯速度，幫助信號肽序列與SRP的結合［79］。但至今，在枯草芽孢桿菌表達系統中沒有報道過改變外源蛋白信號肽中的稀有密碼子的方式來提高分泌量的研究。

3.5 基于信號肽分泌系統中相關蛋白的改造提高外源蛋白的表達

枯草芽孢桿菌將外源蛋白分泌到胞外培養基中，除了必須有信號肽引導外，還需要一系列相關蛋白的參與，包括靶向因子、轉運酶、信號肽酶、分子伴侶和胞外蛋白酶，通過改造這些相關蛋白也可以提高外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達［80］。（1）靶向因子是將待分泌蛋白從細胞質內轉移至轉運酶上的輔助蛋白，在枯草芽孢桿菌表達系統中有FtsY和CsaA這兩種輔助蛋白靶向因子［80］。研究表明過表達FtsY和CsaA蛋白，可以提高目標蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌量（US 6410262），相反，抑制了這兩種蛋白的表達，目標蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌量也會相應的降低［80-82］。（2）分泌外源蛋白時跨膜是在轉運酶復合體幫助下完成的，Kakeshtia等［83］刪除了SecA的C末端區域，成功的提高了堿性纖維素酶和干擾素在枯草芽孢桿菌中的胞外分泌量；另外，對SecA的C末端區的點突變也可以提高PhoB蛋白的分泌量（EP 1633873）。過表達轉運酶組分中的相關蛋白也是提高外源蛋白分泌量的有效措施之一，如Mulder等［84］首次人工構建了SecYEG操縱子，并最終增加了枯草芽孢桿菌分泌淀粉酶的產量。Genecor公司通過SecA、SecDF和SecG的過表達，發現可以增強某些異源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌（EP 1003872、US 7807808、US 6258563）。（3）信號肽酶的不足可能會導致信號肽切割效率的下降，研究發現，ClpXP蛋白酶的缺失可以提高sipS、sipT和sipV信號肽酶基因的轉錄水平，從而提高了信號肽的加工過程并增加了蛋白分泌速率［4］，同時還發現，當敲除sipS基因后，AmyQ信號肽的切割效率則有明顯提高；另一方面，過表達信號肽酶sipI也增強了宿主切割AmyQ信號肽的能力［85］。所以對信號肽酶進行過表達，或者解除某些信號肽酶相互之間的抑制有望增加某些異源分泌蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達量［80］。（4）分子伴侶能夠降低待分泌蛋白錯誤折疊的概率，增加被靶向因子的識別。Wu等［86］失活HrcA導致胞內分子伴侶組成型表達，使得scFV的分泌量增加了60%，另外，過表達胞外分子伴侶prsA也導致了scFV總量增加，進一步共表達胞內和胞外伴侶則導致了scFV分泌量更加明顯的增加。這與Kontinen等［87］報道的過表達prsA后，淀粉酶和蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的分泌量分別提高了6倍和2倍是一致的。因此，促進外源蛋白在細胞膜外進行快速折疊的手段，有望增加某些分泌蛋白的胞外分泌量。（5）敲除枯草芽孢桿菌宿主菌中的蛋白酶基因也能有效提高外源蛋白的分泌 量［2-4，26］。目前商業化的WB800就是敲除了8個胞外蛋白酶基因，但敲除過多的蛋白酶基因會帶來菌株生長活力下降的問題。

4 總結與展望

近年來，枯草芽孢桿菌表達系統因其在蛋白表達純化和分泌活性蛋白等方面要明顯優于大腸桿菌，已成為比較熱門的表達體系之一。學者們經過多年的不懈努力，如今雖建立了一套有效的外源蛋白枯草表達系統，并且在外源蛋白表達方面也取得了很大的進展，但相比大腸桿菌表達系統，還是遠遠滯后的。外源蛋白在枯草芽孢桿菌中能否實現高效表達，信號肽是關鍵元件之一，適配的信號肽甚至能夠提高外源蛋白表達量高達數十倍。目前，國內外學者主要針對枯草芽孢桿菌信號肽的Sec和Tat分泌途徑進行研究，基于信號肽的簡單替換、突變、構建高通量文庫和改造分泌途徑中相關蛋白的方式來提高外源蛋白的表達量，雖取得了一定的進展，但仍有上升空間。作者認為未來的研究方向應該集中以下方面：（1）增加枯草芽孢桿菌信號肽的基礎研究與應用，證明這種潛在的工業細菌將通過不斷優化可成為超級分泌細胞工廠。在信號肽分泌途徑研究方面，尤其是Sec和Tat途徑，仍然需要進一步研究了解每個信號肽和分泌途徑的功能及其相互作用，特別是Tat途徑信號肽，雖然在數量上較少，但似乎更能提高外源蛋白分泌量，這可能與其轉運途徑中參與蛋白有關。（2）可以基于生物信息學，針對信號肽的結構，N端所帶正電荷數為+2或+3，降低H端的疏水性，模擬其在分泌途徑中的可行性，在一定理論基礎上，建立一套實用性的預測平臺，降低工作量的同時確保提高外源蛋白分泌效率的準確性。（3）基于信號肽分泌途徑中相關蛋白的單個或多種基因的組合過表達，提高其在外源蛋白轉運途徑中的工作效率，使得外源蛋白的轉運、加工、折疊和分泌更加高效，胞外分泌量也會相應提高。 （4）結合其他蛋白表達優化方法：如啟動子、稀有密碼子、代謝工程技術、轉錄組學、蛋白組學和基因編輯等技術，通過整體策略提高外源蛋白的分泌表達。總之，從本質上研究分泌途徑的機制、信號肽優選方式和影響因素是至關重要的，為未來進一步擴大枯草芽孢桿菌的高效工業應用的范圍提供理論和實驗依據。