階梯緩釋抗結(jié)核納米人工骨復(fù)合體的生物安全性研究

席焱海++++何海龍++李坤++++++劉希麟++薛敏濤+++++徐寧+++葉曉健

[摘要] 目的 研究階梯緩釋抗結(jié)核納米人工骨復(fù)合體（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）的生物安全性。 方法 對β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體進(jìn)行體外噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞毒性實(shí)驗，動物體內(nèi)急性全身毒性實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗和致敏實(shí)驗，并設(shè)置對照組進(jìn)行比較。 結(jié)果 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗顯示人工骨材料組細(xì)胞存活率在95%以上，細(xì)胞毒性1級。人工骨復(fù)合材料浸取液不引起豚鼠過敏。原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗和皮內(nèi)刺激實(shí)驗均提示復(fù)合材料對兔皮膚、皮內(nèi)無刺激反應(yīng)。小鼠尾靜脈注射后未出現(xiàn)明顯全身毒性反應(yīng)。 結(jié)論 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA無明顯細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性，在應(yīng)用過程中能夠降低直接使用抗結(jié)核藥物所帶來的生物毒性。動物全身毒性反應(yīng)、皮膚/內(nèi)刺激反應(yīng)和急性過敏反應(yīng)提示該材料具有良好的生物安全性。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核；藥物緩釋；納米；生物安全性

[中圖分類號] R943[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（c）-0022-05

Biological security of ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone

XI Yanhai HE Hailong LI Kun LIU Xilin XUE Mintao XU Ning YE Xiaojian▲

Department of Spinal Surgery, Orthopaedic Hospital of Shanghai Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

[Abstract] Objective To investigate the biological security of ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone (β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA). Methods MTT toxicity test, acute systemic toxicity test, intracutaneous irritation test and skin sensitization in stimulation were performed in the ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone. The results were compared with control group. Results MTT toxicity test showed that the survival rate of bone cells in artificial materials was more than 95% and cytotoxicity was on grade 1. Artificial bone composite material liquid did not cause allergic reaction in guinea pig. Primary skin irritation experiments and intradermal stimulation experiment suggested that composite materials to rabbit skin and intracutaneous no stimulation reaction. No obvious systemic toxic reaction was found in mice after intravenous injection. Conclusion There is no MTT cytotoxicity in the ladder-sustained-release anti-TB drugs artificial composite bone. It can reduce the biological toxicity of anti-TB drugs and will not cause systemic toxic reaction, skin/hypodermic stimulation reactions and acute allergic reaction. It has good cell compatibility and biological security.

[Key words] Tuberculosis; Drug-release; Nanometer; Biosecurity

病灶清除術(shù)后骨缺損區(qū)植骨治療是骨結(jié)核病常用的手術(shù)治療手段，與此同時，全身使用抗結(jié)核藥物仍是必要的。然而全身用藥方式實(shí)際到達(dá)局部病灶的濃度很低，甚至在血供不豐富的局部組織抗結(jié)核藥物根本無法到達(dá)。病灶清除后使用搭載緩釋型抗結(jié)核藥物人工骨材料進(jìn)行植骨來加強(qiáng)抗局部抗結(jié)核治療是一種有效的治療方式。考慮到結(jié)核藥物治療需要遵循長程、聯(lián)合、足量等原則，本研究設(shè)計出一種新型搭載利福平（RFP）、異煙肼（INH）、硫酸鏈霉素三藥抗結(jié)核藥物的階梯緩釋型人工骨材料。通過靜電紡絲技術(shù)以高分子聚合物聚己內(nèi)酯（PCL）為載體，制得負(fù)載RFP、INH兩藥的電紡納米纖維薄膜，用壓片機(jī)將其與磷酸三鈣（β-TCP）、PCL等賦形劑混合壓制得到人工骨，將硫酸鏈霉素（SM）和海藻酸鈉（SA）與得到的人工骨通過交聯(lián)固化方式最終制備成階梯緩釋抗結(jié)核納米人工骨（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）。對生物材料進(jìn)行有效性和安全性評價是生物材料進(jìn)入臨床前的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此本實(shí)驗擬通過體外噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞毒性實(shí)驗，動物體內(nèi)急性全身毒性實(shí)驗、皮膚/皮內(nèi)刺激實(shí)驗和致敏實(shí)驗，并設(shè)置對照組進(jìn)行比較，對該復(fù)合材料其生物安全性進(jìn)行測試，以證實(shí)其生物安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA制備：精密稱定分子量為8萬的PCL 0.24 g，RFP粉末0.012 g，INH粉末0.012 g，加入氯仿，得到的溶液在30℃，電壓為15 kV，流量為0.5 mL/h，接收距離為21 cm的條件下紡絲4 h，分別得到含INH和RFP的藥膜。精密稱定特制粉末[β-TCP∶PCL∶NaCl（1∶8∶1）]0.1 g放置于模具中，與INH藥膜、RFP藥膜交替加載。使用粉末壓片機(jī)在14 kPa壓力下，壓制2 min，取出，放置去離子水中浸泡72 h，除去NaCl，取出，晾干，得到β-TCP/INH-RFP-PCL。精確稱取質(zhì)量百分比濃度為1 mg/mL的SA 10 g，SM 5 g，氯化鈣10 g，SA和SM加8.5 mL去離子水?dāng)嚢枞芙猓然}用10 mL去離子水溶解，將含有INH和RFP的去鹽人工骨置于SA溶液中超聲浸泡5 min，接著置于氯化鈣溶液中交聯(lián)固化10 min，該混合物取出晾干，即可制得抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA。每克復(fù)合體中INH、RFP、SM三種藥的載藥量分別達(dá)到0.04、0.08、0.10 g。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體細(xì)胞毒性的MTT測定以MC-3T3為實(shí)驗細(xì)胞，設(shè)置空白組、對照組、實(shí)驗組，實(shí)驗組分為①β-TCP組；②INH-RFP-SM直接給藥組，根據(jù)藥物最低殺菌濃度分為：半量最低殺菌濃度、最低殺菌濃度、2倍最低殺菌濃度；③β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體組。MC3T3-E1細(xì)胞放置α-MEM培養(yǎng)液中生長，待細(xì)胞長成單層后傳代，移去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，37℃條件下消化1～2 min，加入適量的α-MEM培養(yǎng)液，調(diào)配至細(xì)胞分散均勻，制成1×104/cm2的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，使細(xì)胞貼壁，移除培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2環(huán)境下，用α-MEM培養(yǎng)基按材料表面積/溶液量（cm2/mL）=2的比例進(jìn)行浸提72 h后，收集浸提液，然后用0.2 μm的微孔濾膜過濾除菌備細(xì)胞實(shí)驗用。加入50 μL的α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS）及50 μL的浸提液作為實(shí)驗組；在α-MEM培養(yǎng)基中不加入浸提液及細(xì)胞的作為空白組；在α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS）中不加入浸提液的作為對照組。在37℃、5%CO2條件下，在不同培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)至7 d。然后采用MTT法檢測吸光度值，即分別培養(yǎng)1、4、7 d后每孔加入20 μL的MTT（5 mg/L）試劑孵育4 h后，棄上清液，再加入100 μL二甲亞砜（DMSO），震蕩10 min后置入在490 nm波長下，在免疫酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度（OD值）。計算活細(xì)胞的存活率SR（cell survival rate）。SR=（實(shí)驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。最后轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的細(xì)胞毒性等級，標(biāo)準(zhǔn)為：0級 ≥ 100%；1級75%～<100%；2級50%～<75%；3級25%～<50%；4級0%～<25%；5級<0%。

1.2.2 致敏實(shí)驗選擇實(shí)驗用成年豚鼠20只（雌雄不拘），3個月齡，體重350～400 g。操作方法：以豚鼠兩側(cè)肩胛骨內(nèi)緣處進(jìn)行皮內(nèi)注射。實(shí)驗材料浸提液制備：將1 g復(fù)合材料于生理鹽水中浸提72 h（37℃）。設(shè)置分組：實(shí)驗組10只：注射實(shí)驗材料浸取液0.1 mL；陰性對照組5只：注射生理鹽水0.1 mL；陽性對照組5只，注射2%二硝基氟苯0.1 mL。注射完成后1、2、3 d分別觀察各組皮膚反應(yīng)情況，皮膚反應(yīng)分類標(biāo)準(zhǔn)見表1。每組出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動物數(shù)超過總數(shù)30%即判定該組為變態(tài)反應(yīng)致敏陽性。

表1 皮膚反應(yīng)分類標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 皮膚刺激實(shí)驗使用清潔級健康成年新西蘭兔6只，雌雄兼用，品系、飼養(yǎng)條件統(tǒng)一，體重不低于2 kg。實(shí)驗前1天將實(shí)驗用兔固定后，于兔背部脊柱兩側(cè)被毛（約10 cm×15 cm區(qū)域，用8%硫化鈉溶液進(jìn)行脫毛）。設(shè)置12片被皮區(qū)，大小為25 mm×25 mm，脊柱左右各6片，其中6片實(shí)驗組，3片陽性對照組，3片陰性對照組。實(shí)驗組使用濾紙或紗布塊充分吸附復(fù)合材料的浸提液（制備過程同致敏實(shí)驗）至飽和，陰性對照組吸附生理鹽水，陽性對照組吸附3.5%甲醛溶液，貼敷于消毒后的實(shí)驗部位，陰、陽對照組與實(shí)驗組交叉放置。用包扎帶進(jìn)行半封閉式固定4 h以上，去除包扎帶和貼敷物，用溫水清潔貼敷區(qū)并吸干，觀察皮膚的紅斑及水腫情況。分別在1、2、3 d時間點(diǎn)記錄各接觸部位情況，如存在持久性損傷有必要延長觀察時間，以判斷損傷是否可逆。最后參考表1皮膚反應(yīng)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記分，并計算原發(fā)刺激指數(shù)（primary stimulus index，PSI）：PSI=1、2、3 d的紅斑、水腫總分/觀察總數(shù)。反應(yīng)類型結(jié)果評價為：無刺激0～<0.5分；輕度刺激0.5～<2.0分；中度刺激2.0～<5.0分；強(qiáng)刺激5.0～8.0分。

1.2.4 皮內(nèi)刺激實(shí)驗使用清潔級健康成年新西蘭兔4只，雌雄兼用，品系、飼養(yǎng)條件統(tǒng)一，體重不低于2 kg。實(shí)驗前1天將實(shí)驗用兔固定后，于兔背部脊柱兩側(cè)被毛（約10 cm×20 cm區(qū)域，用8%硫化鈉溶液進(jìn)行脫毛）。實(shí)驗動物脊柱兩側(cè)旁開2.5 cm縱線上各取10個皮內(nèi)注射點(diǎn)，每點(diǎn)間距2 cm。一側(cè)注射復(fù)合材料浸取液（制備過程同致敏實(shí)驗）0.2 mL，另一側(cè)注射生理鹽水作0.2 mL為對照。注射后于1、2、3 d觀察局部及周圍皮膚組織反應(yīng)，并按表1所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記分，再根據(jù)記分結(jié)果推算PSI和平均原發(fā)刺激指數(shù)（average primary stimulus index，APSI），APSI=所有動物PSI總和/動物數(shù)。反應(yīng)類型結(jié)果評價同皮膚刺激實(shí)驗。

1.2.5 急性全身毒性實(shí)驗采用實(shí)驗驗用小鼠健康合格，同一品系，須在同一飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，雌雄不拘，雌鼠應(yīng)無孕，體重17～23 g。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗組和對照組，每組10只。將小鼠放入固定器內(nèi)，自尾靜脈分別注入復(fù)合材料浸提液（制備過程同致敏實(shí)驗）（實(shí)驗組）和生理鹽水（對照組），注射劑量為50 mL/kg，注射速度為0.1mL/s。注射完畢后，觀察小鼠即時反應(yīng)，如發(fā)現(xiàn)有血或供試液外溢現(xiàn)象，棄去此小鼠，另取小鼠依法操作。實(shí)驗后飼養(yǎng)法同實(shí)驗前，并于1、2、3 d，觀察和記錄實(shí)驗組和對照組動物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)。實(shí)驗組和對照組小鼠如出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，則根據(jù)其癥狀程度記為無中毒、輕度中毒、明顯中毒、重度中毒和死亡，急性全身毒性實(shí)驗中的動物反應(yīng)指標(biāo)見表2。根據(jù)觀察結(jié)果作出評價。

表2 急性全身毒性實(shí)驗中的動物反應(yīng)指標(biāo)

2 結(jié)果

2.1 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體采用MTT法觀察并通過計算生存率方式測試復(fù)合體的細(xì)胞毒性。結(jié)果見圖1。β-TCP組7 d內(nèi)的生存率為基本為100%，三種抗結(jié)核藥直接給藥組細(xì)胞存活率相對較低，低于90%，β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體實(shí)驗組7 d內(nèi)存活率>95%。說明本實(shí)驗材料具有良好細(xì)胞相容性，無明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性等級，空白對照組：0級；實(shí)驗組：1級；RFP直接給藥組：1級。

①：半量最低殺菌濃度；②：最低殺菌濃度；③：2倍最低殺菌濃度

圖1 噻唑藍(lán)細(xì)胞毒性實(shí)驗結(jié)果

2.2致敏實(shí)驗

實(shí)驗組所有豚鼠未出現(xiàn)明顯皮膚過敏反應(yīng)，與生理鹽水陰性對照組結(jié)果相同；注射二硝基氟苯陽性對照組豚鼠全部出現(xiàn)過敏反應(yīng)，超過總數(shù)30%判定為致敏陽性。

2.3原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體實(shí)驗組在家兔皮膚實(shí)驗區(qū)域未見紅斑、水腫，PSI指數(shù)為0，評價為無刺激，同生理鹽水陰性對照組。而3.5%甲醛溶液陽性對照組PSI為3，評價為對皮膚中度刺激。見表3。

表3 各組別不同時間下原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗皮膚反應(yīng)得分情況

2.4皮內(nèi)刺激實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合材料實(shí)驗組在實(shí)驗后1、2、3 d紅斑和水腫情況基本為無，少數(shù)有微弱紅斑、水腫反應(yīng)。通過各個時間點(diǎn)結(jié)果記分，計算出刺激指數(shù)，最后計算出平均刺激指數(shù)實(shí)驗組為0.32，對照組為0.11。各實(shí)驗組刺激指數(shù)和平均刺激指數(shù)評價為無刺激，同生理鹽水對照組。見表4。

表4 各組不同動物編號皮內(nèi)刺激實(shí)驗結(jié)果

2.5急性全身毒性實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合材料實(shí)驗組小鼠尾靜脈注射后1、2、3 d進(jìn)行觀察，有2只小鼠1 d時出現(xiàn)輕度精神異常，2 d后恢復(fù)，余小鼠未見明顯異常表現(xiàn)，評價結(jié)果為無中毒。對照組所有小鼠無不良反應(yīng)出現(xiàn)，同樣評價為無中毒。延長觀察時間至2周，小鼠未見明顯異常。見表5。

表5 不同組別不同急性全身毒性實(shí)驗結(jié)果

3 討論

組織工程生物材料由于要長期甚至終生與人體相接觸，因此對其安全性的評價非常重要。本文實(shí)驗對象的階梯緩釋抗結(jié)核人工骨復(fù)合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三種抗結(jié)核藥物。其中β-TCP作為骨支架材料，在臨床和各類實(shí)驗研究均得到廣泛應(yīng)用，取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。該材料具有較強(qiáng)的細(xì)胞相容性，降解完全，能夠與周圍的正常的骨組織直接結(jié)合，達(dá)到可靠的骨修復(fù)作用[1]。以β-TCP為基礎(chǔ)制備的多種復(fù)合材料或載藥材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化學(xué)合成的生物降解性高分子材料。它的分子結(jié)構(gòu)中引入了酯基結(jié)構(gòu)，在自然界中酯基結(jié)構(gòu)易被微生物或酶分解，最終產(chǎn)物為CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和無毒性，而被廣泛用作醫(yī)用生物降解材料及藥物控制釋放體系[5-7]。SA屬天然有機(jī)高分子化合物，同樣具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性。能夠作為釋放和包埋RFP等藥物的載體[8]，并被證實(shí)安全有效。筆者在既往研究中制備了單載RFP抗結(jié)核藥物的緩釋型人工骨復(fù)合體（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的釋藥效能和成骨性能的同時兼具良好的生物安全性[9-10]。證實(shí)使用多種復(fù)合材料并搭載合理濃度的藥物制備的生物材料是安全可行的。

本研究在制作單載抗結(jié)核藥物復(fù)合人工骨的基礎(chǔ)上，通過工藝的改進(jìn)并引進(jìn)靜電紡絲技術(shù)，研制出搭載3種抗結(jié)核藥物的新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有較大的表面孔徑，呈多孔形態(tài)，孔隙率較大，微孔分布均勻，孔徑內(nèi)部光滑，內(nèi)部附著載藥納米紡絲纖維與多孔間連接，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。靜電紡絲工藝是通過靜電力的作用來合成纖維。其制備的納米纖維能夠模仿組織器官的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)尺寸。纖維支架具有相互連接的空隙的多孔結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的比表面，利于細(xì)胞的黏附及生長。可將不同聚合物的共混，并且加入無機(jī)材料等添加物制各成復(fù)合纖維以適應(yīng)不同需求[11]。使用靜電紡絲法工藝，可以很方便對搭載藥物的載體進(jìn)行塑形，同時載藥膜具備較大的接觸面積易于藥物搭載和釋放。利用靜電紡絲技術(shù)制作的組織工程支架、載藥載體等均證實(shí)具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其載藥量在局部能實(shí)現(xiàn)長達(dá)3個月有效緩釋，局部藥物緩釋濃度能達(dá)到每種藥品的最低殺菌濃度。該材料主要成分在既往實(shí)驗中雖已獲得生物安全性認(rèn)可，但復(fù)合后并搭載3種抗結(jié)核藥物研制成的新型復(fù)合材料，其安全性如何，是否對人體具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潛在危害，仍是必須關(guān)注的問題。同時一種醫(yī)用材料在正式投入生物體研究或臨床應(yīng)用前，必須依照國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，對其進(jìn)行生物安全性評價。

對生物材料的生物安全性評價方法主要有兩類[17]：動物體內(nèi)實(shí)驗和體外實(shí)驗。前者是將材料植入實(shí)驗動物體內(nèi)后，觀察材料及周圍組織病理變化，評價組織相容性。后者是用材料或材料浸提液，在動物體外進(jìn)行一系列研究，測試材料對組織細(xì)胞增殖、生長、分化等活動的影響，以MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗為代表[18]。這一方法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，目前己成為生物材料和醫(yī)療器械生物評價體系中最重要的指標(biāo)之一。其在分析生物材料是否具有毒性和對細(xì)胞的影響方面比體內(nèi)實(shí)驗具有更高的敏感性。本實(shí)驗材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體最終需要在體內(nèi)長期內(nèi)置，因此根據(jù)國家制定醫(yī)用材料生物安全性評價要求，選用致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗和急性全身毒性實(shí)驗評價本材料的生物安全性。

本實(shí)驗結(jié)果顯示新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT實(shí)驗中7 d內(nèi)細(xì)胞存活率>95%，較空白對照組稍低，但明顯高于RFP直接給藥陽性對照組<85%，說明本實(shí)驗材料具有良好細(xì)胞相容性，無明顯的細(xì)胞毒性。材料組中抗結(jié)核藥物載量遠(yuǎn)高于直接給藥組，而細(xì)胞存活率卻較高，說明抗結(jié)核藥物在復(fù)合入生物材料并制備成緩釋形態(tài)后，能夠降低抗結(jié)核藥物直接給藥所產(chǎn)生的毒性。致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗、急性全身毒性實(shí)驗等體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果表明本實(shí)驗材料無毒，無致敏性。因此，階梯緩釋抗結(jié)核藥物納米人工骨復(fù)合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能夠投入到進(jìn)一步的生物體實(shí)驗研究中。

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[12]馬驍.靜電紡絲制備PLGA三維組織工程支架的研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2013.

[13]何莉，王立新，張幼珠，等.載藥聚乳酸纖維膜的制備及釋藥性能研究[J].合成纖維，2007，36（9）：19-21，25.

[14]趙俊成.負(fù)載凝血酶可溶性雞蛋殼膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同靜電紡絲止血材料的研究[D].北京：解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2013.

[15]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16175-2008.

[16]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)療器械生物學(xué)評價——第1部分：風(fēng)險管理過程中的評價與試驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]張真，盧曉風(fēng)，李幼平，等.生物材料有效性和安全性評價的現(xiàn)狀與趨勢[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：衛(wèi)軻）

2.5急性全身毒性實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合材料實(shí)驗組小鼠尾靜脈注射后1、2、3 d進(jìn)行觀察，有2只小鼠1 d時出現(xiàn)輕度精神異常，2 d后恢復(fù)，余小鼠未見明顯異常表現(xiàn)，評價結(jié)果為無中毒。對照組所有小鼠無不良反應(yīng)出現(xiàn)，同樣評價為無中毒。延長觀察時間至2周，小鼠未見明顯異常。見表5。

表5 不同組別不同急性全身毒性實(shí)驗結(jié)果

3 討論

組織工程生物材料由于要長期甚至終生與人體相接觸，因此對其安全性的評價非常重要。本文實(shí)驗對象的階梯緩釋抗結(jié)核人工骨復(fù)合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三種抗結(jié)核藥物。其中β-TCP作為骨支架材料，在臨床和各類實(shí)驗研究均得到廣泛應(yīng)用，取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。該材料具有較強(qiáng)的細(xì)胞相容性，降解完全，能夠與周圍的正常的骨組織直接結(jié)合，達(dá)到可靠的骨修復(fù)作用[1]。以β-TCP為基礎(chǔ)制備的多種復(fù)合材料或載藥材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化學(xué)合成的生物降解性高分子材料。它的分子結(jié)構(gòu)中引入了酯基結(jié)構(gòu)，在自然界中酯基結(jié)構(gòu)易被微生物或酶分解，最終產(chǎn)物為CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和無毒性，而被廣泛用作醫(yī)用生物降解材料及藥物控制釋放體系[5-7]。SA屬天然有機(jī)高分子化合物，同樣具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性。能夠作為釋放和包埋RFP等藥物的載體[8]，并被證實(shí)安全有效。筆者在既往研究中制備了單載RFP抗結(jié)核藥物的緩釋型人工骨復(fù)合體（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的釋藥效能和成骨性能的同時兼具良好的生物安全性[9-10]。證實(shí)使用多種復(fù)合材料并搭載合理濃度的藥物制備的生物材料是安全可行的。

本研究在制作單載抗結(jié)核藥物復(fù)合人工骨的基礎(chǔ)上，通過工藝的改進(jìn)并引進(jìn)靜電紡絲技術(shù)，研制出搭載3種抗結(jié)核藥物的新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有較大的表面孔徑，呈多孔形態(tài)，孔隙率較大，微孔分布均勻，孔徑內(nèi)部光滑，內(nèi)部附著載藥納米紡絲纖維與多孔間連接，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。靜電紡絲工藝是通過靜電力的作用來合成纖維。其制備的納米纖維能夠模仿組織器官的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)尺寸。纖維支架具有相互連接的空隙的多孔結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的比表面，利于細(xì)胞的黏附及生長。可將不同聚合物的共混，并且加入無機(jī)材料等添加物制各成復(fù)合纖維以適應(yīng)不同需求[11]。使用靜電紡絲法工藝，可以很方便對搭載藥物的載體進(jìn)行塑形，同時載藥膜具備較大的接觸面積易于藥物搭載和釋放。利用靜電紡絲技術(shù)制作的組織工程支架、載藥載體等均證實(shí)具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其載藥量在局部能實(shí)現(xiàn)長達(dá)3個月有效緩釋，局部藥物緩釋濃度能達(dá)到每種藥品的最低殺菌濃度。該材料主要成分在既往實(shí)驗中雖已獲得生物安全性認(rèn)可，但復(fù)合后并搭載3種抗結(jié)核藥物研制成的新型復(fù)合材料，其安全性如何，是否對人體具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潛在危害，仍是必須關(guān)注的問題。同時一種醫(yī)用材料在正式投入生物體研究或臨床應(yīng)用前，必須依照國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，對其進(jìn)行生物安全性評價。

對生物材料的生物安全性評價方法主要有兩類[17]：動物體內(nèi)實(shí)驗和體外實(shí)驗。前者是將材料植入實(shí)驗動物體內(nèi)后，觀察材料及周圍組織病理變化，評價組織相容性。后者是用材料或材料浸提液，在動物體外進(jìn)行一系列研究，測試材料對組織細(xì)胞增殖、生長、分化等活動的影響，以MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗為代表[18]。這一方法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，目前己成為生物材料和醫(yī)療器械生物評價體系中最重要的指標(biāo)之一。其在分析生物材料是否具有毒性和對細(xì)胞的影響方面比體內(nèi)實(shí)驗具有更高的敏感性。本實(shí)驗材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體最終需要在體內(nèi)長期內(nèi)置，因此根據(jù)國家制定醫(yī)用材料生物安全性評價要求，選用致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗和急性全身毒性實(shí)驗評價本材料的生物安全性。

本實(shí)驗結(jié)果顯示新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT實(shí)驗中7 d內(nèi)細(xì)胞存活率>95%，較空白對照組稍低，但明顯高于RFP直接給藥陽性對照組<85%，說明本實(shí)驗材料具有良好細(xì)胞相容性，無明顯的細(xì)胞毒性。材料組中抗結(jié)核藥物載量遠(yuǎn)高于直接給藥組，而細(xì)胞存活率卻較高，說明抗結(jié)核藥物在復(fù)合入生物材料并制備成緩釋形態(tài)后，能夠降低抗結(jié)核藥物直接給藥所產(chǎn)生的毒性。致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗、急性全身毒性實(shí)驗等體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果表明本實(shí)驗材料無毒，無致敏性。因此，階梯緩釋抗結(jié)核藥物納米人工骨復(fù)合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能夠投入到進(jìn)一步的生物體實(shí)驗研究中。

[參考文獻(xiàn)]

[1]LeGeros RZ. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics [J].Clin Mater，1993，14（1）：65-88.

[2]胡紅濤.孔壁表現(xiàn)納米化的nHA晶須增強(qiáng)多孔骨支架的制備與性能研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2012.

[3]張智星.控釋性可注射牙槽骨修復(fù)材料的生物學(xué)性能研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2009.

[4]郭洪剛，劉靜，李峰坦，等.新型納米化仿生骨基質(zhì)與羊脂肪基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的生物相容性[J].中國組織工程研究，2012，16（16）：2889-2892.

[5]王昊，周志平，戴曉暉，等.溫敏性聚己內(nèi)酯-聚N-異丙基丙烯酰胺作為抗癌藥物載體的制備與藥物釋放的研究[J].功能材料，2013，44（3）：435-441.

[6]王永生.VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構(gòu)建及體外血液相容性和生物學(xué)活性的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2012.

[7]Tseng H，Puperi DS，Kim EJ，et al. Anisotropic poly（ethylene glycol）/polycaprolactone （PEG/PCL） hydrogel-fiber composites for heart valve tissue engineering [J]. Tissue Eng Part A，2014，8：10.

[8]石拯拯，李海斌，曹建霞，等.利福平海藻酸鈉微球栓塞劑的制備及體外釋藥研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（11）：1727-1730.

[9]席焱海，薛敏濤，葉曉健，等.交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨體內(nèi)成骨的觀察[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013， 93（19）：1494-1498.

[10]席焱海，薛敏濤，葉曉健，等.交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨復(fù)合體的生物安全性研究[J].脊柱外科雜志，2012，10（4）：247-250.

[11]Zhang YZ， OUYang HW， Chwee TL，et al. Electrospinning of gelatin fibers and gelatin/PCL composite fibrous scaffolds [J]. Wiley Inter Science，2004，（72）：156-165.

[12]馬驍.靜電紡絲制備PLGA三維組織工程支架的研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2013.

[13]何莉，王立新，張幼珠，等.載藥聚乳酸纖維膜的制備及釋藥性能研究[J].合成纖維，2007，36（9）：19-21，25.

[14]趙俊成.負(fù)載凝血酶可溶性雞蛋殼膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同靜電紡絲止血材料的研究[D].北京：解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2013.

[15]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16175-2008.

[16]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)療器械生物學(xué)評價——第1部分：風(fēng)險管理過程中的評價與試驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]張真，盧曉風(fēng)，李幼平，等.生物材料有效性和安全性評價的現(xiàn)狀與趨勢[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：衛(wèi)軻）

2.5急性全身毒性實(shí)驗

β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合材料實(shí)驗組小鼠尾靜脈注射后1、2、3 d進(jìn)行觀察，有2只小鼠1 d時出現(xiàn)輕度精神異常，2 d后恢復(fù)，余小鼠未見明顯異常表現(xiàn)，評價結(jié)果為無中毒。對照組所有小鼠無不良反應(yīng)出現(xiàn)，同樣評價為無中毒。延長觀察時間至2周，小鼠未見明顯異常。見表5。

表5 不同組別不同急性全身毒性實(shí)驗結(jié)果

3 討論

組織工程生物材料由于要長期甚至終生與人體相接觸，因此對其安全性的評價非常重要。本文實(shí)驗對象的階梯緩釋抗結(jié)核人工骨復(fù)合材料主要包括β-TCP、PCL、SA、INH、RFP和SM三種抗結(jié)核藥物。其中β-TCP作為骨支架材料，在臨床和各類實(shí)驗研究均得到廣泛應(yīng)用，取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。該材料具有較強(qiáng)的細(xì)胞相容性，降解完全，能夠與周圍的正常的骨組織直接結(jié)合，達(dá)到可靠的骨修復(fù)作用[1]。以β-TCP為基礎(chǔ)制備的多種復(fù)合材料或載藥材料均具有良好的生物相容性及安全性[2-4]。PCL是化學(xué)合成的生物降解性高分子材料。它的分子結(jié)構(gòu)中引入了酯基結(jié)構(gòu)，在自然界中酯基結(jié)構(gòu)易被微生物或酶分解，最終產(chǎn)物為CO2和H2O，具有良好的生物降解性、生物相容性和無毒性，而被廣泛用作醫(yī)用生物降解材料及藥物控制釋放體系[5-7]。SA屬天然有機(jī)高分子化合物，同樣具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性。能夠作為釋放和包埋RFP等藥物的載體[8]，并被證實(shí)安全有效。筆者在既往研究中制備了單載RFP抗結(jié)核藥物的緩釋型人工骨復(fù)合體（TPB/SA-RFP/PLA、PLGA、PCL），具有良好的釋藥效能和成骨性能的同時兼具良好的生物安全性[9-10]。證實(shí)使用多種復(fù)合材料并搭載合理濃度的藥物制備的生物材料是安全可行的。

本研究在制作單載抗結(jié)核藥物復(fù)合人工骨的基礎(chǔ)上，通過工藝的改進(jìn)并引進(jìn)靜電紡絲技術(shù)，研制出搭載3種抗結(jié)核藥物的新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA，具有較大的表面孔徑，呈多孔形態(tài)，孔隙率較大，微孔分布均勻，孔徑內(nèi)部光滑，內(nèi)部附著載藥納米紡絲纖維與多孔間連接，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。靜電紡絲工藝是通過靜電力的作用來合成纖維。其制備的納米纖維能夠模仿組織器官的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)尺寸。纖維支架具有相互連接的空隙的多孔結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的比表面，利于細(xì)胞的黏附及生長。可將不同聚合物的共混，并且加入無機(jī)材料等添加物制各成復(fù)合纖維以適應(yīng)不同需求[11]。使用靜電紡絲法工藝，可以很方便對搭載藥物的載體進(jìn)行塑形，同時載藥膜具備較大的接觸面積易于藥物搭載和釋放。利用靜電紡絲技術(shù)制作的組織工程支架、載藥載體等均證實(shí)具有良好的生物相容性及安全性[12-14]。其載藥量在局部能實(shí)現(xiàn)長達(dá)3個月有效緩釋，局部藥物緩釋濃度能達(dá)到每種藥品的最低殺菌濃度。該材料主要成分在既往實(shí)驗中雖已獲得生物安全性認(rèn)可，但復(fù)合后并搭載3種抗結(jié)核藥物研制成的新型復(fù)合材料，其安全性如何，是否對人體具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潛在危害，仍是必須關(guān)注的問題。同時一種醫(yī)用材料在正式投入生物體研究或臨床應(yīng)用前，必須依照國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，對其進(jìn)行生物安全性評價。

對生物材料的生物安全性評價方法主要有兩類[17]：動物體內(nèi)實(shí)驗和體外實(shí)驗。前者是將材料植入實(shí)驗動物體內(nèi)后，觀察材料及周圍組織病理變化，評價組織相容性。后者是用材料或材料浸提液，在動物體外進(jìn)行一系列研究，測試材料對組織細(xì)胞增殖、生長、分化等活動的影響，以MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗為代表[18]。這一方法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，目前己成為生物材料和醫(yī)療器械生物評價體系中最重要的指標(biāo)之一。其在分析生物材料是否具有毒性和對細(xì)胞的影響方面比體內(nèi)實(shí)驗具有更高的敏感性。本實(shí)驗材料β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA復(fù)合體最終需要在體內(nèi)長期內(nèi)置，因此根據(jù)國家制定醫(yī)用材料生物安全性評價要求，選用致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗和急性全身毒性實(shí)驗評價本材料的生物安全性。

本實(shí)驗結(jié)果顯示新型人工骨復(fù)合物β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA材料在MTT實(shí)驗中7 d內(nèi)細(xì)胞存活率>95%，較空白對照組稍低，但明顯高于RFP直接給藥陽性對照組<85%，說明本實(shí)驗材料具有良好細(xì)胞相容性，無明顯的細(xì)胞毒性。材料組中抗結(jié)核藥物載量遠(yuǎn)高于直接給藥組，而細(xì)胞存活率卻較高，說明抗結(jié)核藥物在復(fù)合入生物材料并制備成緩釋形態(tài)后，能夠降低抗結(jié)核藥物直接給藥所產(chǎn)生的毒性。致敏實(shí)驗、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗、皮內(nèi)刺激實(shí)驗、急性全身毒性實(shí)驗等體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果表明本實(shí)驗材料無毒，無致敏性。因此，階梯緩釋抗結(jié)核藥物納米人工骨復(fù)合材料（β-TCP/INH-RFP-PCL/SM-SA）具有良好的生物相容性和安全性，能夠投入到進(jìn)一步的生物體實(shí)驗研究中。

[參考文獻(xiàn)]

[1]LeGeros RZ. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics [J].Clin Mater，1993，14（1）：65-88.

[2]胡紅濤.孔壁表現(xiàn)納米化的nHA晶須增強(qiáng)多孔骨支架的制備與性能研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2012.

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[5]王昊，周志平，戴曉暉，等.溫敏性聚己內(nèi)酯-聚N-異丙基丙烯酰胺作為抗癌藥物載體的制備與藥物釋放的研究[J].功能材料，2013，44（3）：435-441.

[6]王永生.VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構(gòu)建及體外血液相容性和生物學(xué)活性的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2012.

[7]Tseng H，Puperi DS，Kim EJ，et al. Anisotropic poly（ethylene glycol）/polycaprolactone （PEG/PCL） hydrogel-fiber composites for heart valve tissue engineering [J]. Tissue Eng Part A，2014，8：10.

[8]石拯拯，李海斌，曹建霞，等.利福平海藻酸鈉微球栓塞劑的制備及體外釋藥研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（11）：1727-1730.

[9]席焱海，薛敏濤，葉曉健，等.交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨體內(nèi)成骨的觀察[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013， 93（19）：1494-1498.

[10]席焱海，薛敏濤，葉曉健，等.交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨復(fù)合體的生物安全性研究[J].脊柱外科雜志，2012，10（4）：247-250.

[11]Zhang YZ， OUYang HW， Chwee TL，et al. Electrospinning of gelatin fibers and gelatin/PCL composite fibrous scaffolds [J]. Wiley Inter Science，2004，（72）：156-165.

[12]馬驍.靜電紡絲制備PLGA三維組織工程支架的研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2013.

[13]何莉，王立新，張幼珠，等.載藥聚乳酸纖維膜的制備及釋藥性能研究[J].合成纖維，2007，36（9）：19-21，25.

[14]趙俊成.負(fù)載凝血酶可溶性雞蛋殼膜蛋白-聚丁二酸丁二醇酯共同靜電紡絲止血材料的研究[D].北京：解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2013.

[15]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16175-2008.

[16]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.醫(yī)療器械生物學(xué)評價——第1部分：風(fēng)險管理過程中的評價與試驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，GB/T 16886.1-2011.

[17]張真，盧曉風(fēng)，李幼平，等.生物材料有效性和安全性評價的現(xiàn)狀與趨勢[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2002，19（1）：117-121.

[18]Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM. Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive test [J]. Biomaterials，1990， 11（2）：133-137.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：衛(wèi)軻）