一株豬丹毒絲菌的分離鑒定

程玉婷

（廣東省農產品質量安全中心，廣東 廣州 510000）

豬丹毒病是一種在世界范圍內均有發生且對養豬業有重要影響的疾病。豬丹毒病由豬丹毒絲菌引起。豬丹毒絲菌是一種革蘭氏陽性菌、菌體平直或稍彎曲的纖細小桿菌、兼性厭氧、耐酸、無芽孢[1]。豬丹毒絲菌一般感染豬，但同時也可以感染綿羊、火雞和人。豬丹毒絲菌感染人時，可以引起心內膜炎癥、敗血癥[2]。豬丹毒絲菌作為一種條件致病菌，多達10%～50%的健康豬扁桃體中攜帶該菌，并且在健康豬及病豬的唾液、糞便中均可以分離到該病原體，該病最常見的感染途徑是通過攝入受污染的食物或水及皮膚傷口感染，3月齡到3歲豬均易感。豬丹毒菌感染的臨床癥狀有3種：急性、亞急性和慢性[3]。急性型又稱敗血型，發病豬只呈急性經過，體溫突然升至42～43 ℃，食欲不振，糞便干結，后期下痢。病程急，死亡率高。亞急性型也稱疹塊型，豬只耳后、頸部、胸腹側等部位會有紅色形狀的不規則斑塊出現，界限明顯、觸之有熱感，指壓而褪色，俗稱“打火印”。而慢性型一般表現為慢性關節炎、慢性心內膜炎和皮膚壞死等癥狀[4]。豬丹毒病一年四季均可以發病，但以潮濕、炎熱多雨的季節多發[5]。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來自廣東省潮州市某大型豬場，采取新鮮病死豬的肝、脾等臟器進行病原菌分離鑒定。

1.2 細菌培養基和相關試劑

胰酶大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）購自廣東環凱微生物科技有限公司。

新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，使用前56 ℃滅活30 min，保存于-20 ℃。

革蘭氏染色液采購自廣東環凱微生物科技有限公司。

引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 引物合成設計

實驗中所用到的引物（見表1）。

表1 實驗中所用到的引物

1.4 豬丹毒絲菌的分離與鑒定

1）以燒紅的無菌剪刀燙烙病例臟器表面，用接種環自燙烙的部位插入組織中，在無菌的加入5%新生牛血清的TSA平板上涂拭，在超凈工作臺內對平板進行劃線，目的是可以得到單菌落；

2）將劃線稀釋的平板置于生化培養箱培養18～24 h；

3）在平板上挑選單菌落，轉到新鮮的TSA平板（添加5%新生牛血清）上繼續劃線培養18～24 h進行純化；

4）革蘭氏染色鑒定；

5）16S rRNR PCR鑒定

PCR反應、條件體系如下：

TaKaRa Ex Taq（5 units/μL）0.25 μL

10×Ex Taq Buffer（Mg2+free）2 μL

dNTP Mixture（2.5 mM each）2 μL

25 mM MgCl21.5 μL

16SrRNA-F、16SrRNA-R各1.5 μL

dd H2O up to 25 μL

反應總體系為25μL，模板為挑選的3-5個單菌落。PCR反應條件為

1.5 藥物敏感性的測定

藥敏實驗采用Kirby-Baner（K-B）紙片擴散法，檢測分離得到的菌株對抗菌藥物的敏感性。

1）將復蘇好的菌株進行劃線培養，放入恒溫培養箱培養18～24 h；

2）取無菌棉簽蘸取平板上3～5個菌落，于3 mL生理鹽水中進行稀釋，調節菌液濃度至0.5麥氏比濁濃度；

3）另取一無菌棉簽伸入細菌瓶中，待無菌棉簽浸潤后，在細菌瓶管壁上擠壓掉多余的水分，用棉簽涂布TSA平板。為使平板上菌落分布均勻，應涂布完平板后將平板轉動60°，再次進行涂布，依次重復6次；

4）用鑷子夾取藥敏紙片，使藥敏紙片平貼于涂滿菌液的培養基表面，所有藥敏紙片應當在15 min內貼到培養基上；

5）將平板翻轉，置于37 ℃恒溫培養箱培養20～24 h后，將平板從恒溫培養箱中拿出，依據美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）判定標準進行耐藥性的判定。

2 結果

2.1 革蘭氏染色結果

從病變組織中分離培養細菌后，制成細菌涂片，經革蘭氏染色后鏡檢，可觀察到該菌為纖細的小桿菌，成對或呈長絲狀。鏡檢結果見圖1。

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 16SrRNR PCR鑒定結果

從經純化的培養物中挑取3～5個菌落，通過PCR擴增后，經電泳檢驗，出現特異性條帶，目的條帶大小為472 bp，結果見圖2。

圖2 PCR鑒定結果

2.3 藥物敏感性的測定

藥物敏感性的測定結果（見表2）。藥敏測定結果顯示，該豬丹毒絲菌對阿莫西林、青霉素、氟苯尼考敏感，對多西環素中度敏感，對恩諾沙星、替米考星、四環素不敏感。

表2 藥敏測定結果

3 結論與討論

1）以上結果符合豬丹毒絲菌的相應特性，確診為感染豬丹毒絲菌。

2）本株豬丹毒絲菌能引起豬的全身性敗血性死亡，說明毒力較強。經了解，該豬場發病豬群發病時間為5月份，這段時間天氣出現連續性降雨，豬舍糞便清理不夠徹底，環境相對較差，這可能誘發了本次豬群的病因。

3）針對該次豬丹毒絲菌發病，可以選擇性采用阿莫西林、青霉素、氟苯尼考結合實際予以治療。

4）豬丹毒絲菌病不常發，但一旦發病，病程急，病程短，豬場養殖者往往措手不及，養殖者應加強防范。