氟比洛芬酯介導MAPK信號通路保護腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障功能的機制研究

程晶晶，程少飛，遲曉慧

(邯鄲市中心醫院麻醉科，河北 邯鄲 056000)

缺血性腦血管疾病在臨床上具有發病率高、致殘率高和死亡率高等特點[1]。腦缺血在一定時間內恢復血液供應后，如不采取積極的進一步治療，會出現更嚴重的神經功能障礙，即為腦缺血再灌注損傷[2]。尋找療效明確的治療缺血性腦血管疾病的藥物以及機制探討一直是臨床研究的熱點。氟比洛芬酯是一種非甾體類靶向鎮痛消炎藥，國外研究[3]發現，氟比洛芬酯有一定的抗腦缺血再灌注損傷、保護血腦屏障的作用，但作用機制尚未明確。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，MAPK信號通路在基因表達調控中發揮關鍵作用[4]。研究發現[5-6]，MAPK信號通路為參與血腦屏障保護作用的重要通路，p38 MAPK是MAPKs的亞類之一，是此通路的關鍵蛋白。本研究旨在探討氟比洛芬酯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障功能的影響，分析氟比洛芬酯介導磷酸化p38 MAPK信號通路保護血腦屏障功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠72只，體重280～320 g，由邯鄲市中心醫院實驗動物中心提供，并獲實驗倫理委員會審批通過。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注損傷組(IR組)和氟比洛芬酯組(F組)，每組各24只大鼠。氟比洛芬酯注射液購于北京泰德制藥股份有限公司；磷酸化p38 MAPK單克隆抗體試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司；伊文思藍(EB)溶液由美國Sigma公司生產；澳美耐OMNI Sonic Ruptor 4000超聲波細胞破碎儀由美國OMNI公司生產；DR6000 紫外-可見光分光光度計由美國HACH公司生產。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注大鼠模型制作 F組和IR組大鼠采用改良Koizumi線栓法建立腦缺血再灌注經典模型[7]，具體步驟為：腹腔注射10%水合氯醛100 mg進行麻醉，起效后，切開大鼠頸正中皮膚，暴露頸部血管，4-0尼龍線頭端制作成鼓槌狀。分離左側頸總動脈、頸外動脈，并從分叉處插入尼龍線至頸內動脈，深度約17 mm，并保持有一定阻力，以阻斷大腦中動脈起始端所有的側支循環血流造成腦缺血。2 h后，將尼龍線抽出，恢復大腦中動脈血供，即再灌注。Sham組只實施麻醉、切開大鼠頸正中皮膚、分離血管但不結扎大腦中動脈。

1.2.2 給藥方法 再灌注即刻給藥，F組大鼠腹腔注射氟比洛芬酯10 mg/kg，Sham組和IR組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.3 指標檢測 (1)大鼠腦組織含水量檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，斷頭并低溫摘取大鼠腦組織，分離左右大腦半球，先稱濕重，然后置于烤箱烘干水分后稱干重。腦組織含水量百分比=(濕重-干重)/濕重×100%。(2)大鼠血腦屏障通透性檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，股靜脈注入2%伊文思藍(EB)溶液2 mL/kg染色。1 h后，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后打開胸腔，經心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區的腦組織，吸去殘余水分，然后每100 mg腦組織加入甲酰胺溶液1 mL，60 ℃水浴24 h，1 000 rpm離心5 min，用DR6000 紫外-可見光分光光度計在620 nm波長處測吸光度。作出標準曲線，計算腦組織EB含量。肉眼觀察各組大鼠腦組織EB染色形態學大體外觀，并于熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦組織EB紅斑分布。(3)p38 MAPK蛋白表達檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，采用免疫組化技術檢測p38 MAPK蛋白表達。具體方法為：①組織切片制作。麻醉后打開胸腔，經心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區的腦組織，經過脫水、固定、包埋等步驟制作石蠟切片。取500 mL的抗原修復工作液浸泡組織切片，120 ℃加熱煮沸20 min，冷卻至室溫，取出組織切片用磷酸鹽緩沖液沖洗3 min、自來水沖洗3 min。組織切片晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。②SP法進行免疫組化染色。加入p38 MAPK一抗(p38 MAPK的羊抗鼠單克隆抗體工作液)40 μL，另外選取磷酸鹽緩沖液作為一抗的陰性對照，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加二氨基聯苯胺顯色液50 μL，染色時間大約5～10 min，顯微鏡下觀察。③評分標準。由病理中心兩名醫師獨立閱片，采用Bresalier半定量法分兩部分評分[8]。顯色深淺度評分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性細胞數評分：0分為陽性細胞數<5%，1分為陽性細胞數5%～25%，2分為陽性細胞數26%～50%，3分為陽性細胞數51%～75%，4分為陽性細胞數≥76%。累計得分0～1分為(﹣)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。(4)p38 MAPK蛋白相對表達量檢測：再灌注24 h，每組各隨機抽取6只大鼠，采用免疫印跡(Western blot)檢測p38 MAPK蛋白相對表達量。具體方法為：麻醉后打開胸腔，經心臟灌流肝素鈉生理鹽水，斷頭并低溫摘取大鼠缺血區的腦組織，每100 mg組織加入蛋白裂解液1 mL，刀片式組織破碎勻漿器1 000～3 000 rpm高速勻漿3次，離心取上清液，調整所有蛋白樣本至等濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到硝酸纖維束薄膜上，封閉，加入p38 MAPK一抗，室溫下孵育1 h，洗滌；再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，洗滌。采用HRP-ECL發光法曝光，取出膠片浸入顯影液至完全顯影，清水沖凈晾干。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照計算p38 MAPK蛋白的相對表達量。免疫印跡重復試驗至少3次。蛋白含量根據western blot結果條帶的灰度值計算，使用Image J軟件，導入western blot條帶圖片，把圖片轉化成灰度圖片，設置定量參數把Western blot條帶圖片轉換成亮帶，選定亮帶，點擊菜單欄Analyze下拉出現的measurement，彈出選定區域的灰度統計值，重復上述步驟直至所有條帶都被測量。在Excel表格錄入數據，將目的蛋白的灰度值除以GAPDH內參蛋白的灰度值，得到p38 MAPK蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組腦組織含水量比較

F組的腦組織含水量高于Sham組，但低于IR組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組腦組織EB含量比較

F組的腦組織EB含量高于Sham組，但低于IR組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2-圖4。

2.3 各組腦組織切片免疫組化法的p38 MAPK蛋白表達比較

F組的腦組織切片p38 MAPK蛋白陽性表達的等級高于Sham組，但低于IR組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖5。

表1 各組腦組織免疫組化法的p38 MAPK蛋白表達比較[n(%)]

2.4 各組腦組織免疫印跡法的p38 MAPK蛋白相對表達量比較

F組的腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量高于Sham組，但低于IR組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的病理機制較為復雜，目前主流學說提出可能與自由基及脂質過氧化、線粒體功能障礙、細胞內鈣超載、炎癥免疫反應、興奮性氨基酸毒性、高能磷酸化合物缺乏等有關[9-10]。血腦屏障是維持腦組織內環境穩定的重要屏障，可阻止有害物質由血液進入大腦，其功能受損是腦缺血再灌注損傷的重要表現之一，易引起腦水腫，神經元死亡，加重腦損害。本研究采用大鼠腦缺血再灌注經典模型，缺血2 h，再灌注24 h后測大鼠腦組織含水量及EB含量，結果發現，與Sham組比較，IR組的腦組織含水量明顯增高，提示大鼠腦缺血再灌注后發生腦水腫；IR組的EB含量也明顯增高，提示大鼠血腦屏障受到破壞，血腦屏障通透性增加，結果與Guo等[11]研究報道相符，說明建模成功。

近年研究[12]發現，p38 MAPK與血腦屏障功能密切相關。在腦缺血病理情況下，腦組織p38 MAPK表達明顯增加。本研究采用免疫組化法及免疫印跡法檢測p38 MAPK表達量，發現IR組的腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量高于Sham組，提示大鼠腦缺血再灌注后p38 MAPK表達上調，與Jiang等[13]研究報道相符。p38 MAPK是MAPK家族成員之一，參與應激壓力與炎癥細胞因子的激活，p38介導炎癥免疫反應與細胞凋亡，因此目前多將p38作為抗炎藥物的靶位[14-15]。p38 MAPK信號通路也由三級激酶鏈組成，表現為逐級磷酸化，包括MKK3、MKK4及MKK6，是p38的特異性蛋白激酶[16]。

本研究進一步探討了氟比洛芬酯對保護血腦屏障功能的影響及介導MAPK信號通路的機制，結果發現，F組腦組織含水量、腦組織EB含量均低于IR組，提示氟比洛芬酯能降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫。此外，F組腦組織p38 MAPK蛋白相對表達量低于IR組，提示氟比洛芬酯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷、保護血腦屏障功能的機制可能與抑制MAPK信號通路、下調p38 MAPK表達有關。侯莉莉等[17]對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型實施氟比洛芬酯后處理，同樣發現缺血區腦組織的p38 MAPK表達下調，并認為氟比洛芬酯降低血腦屏障通透性的機制可能與其抑制p38 MAPK信號通路激活有關。Wu等[18]采取氟比洛芬酯預先給藥，腦組織含水量和EB含量均降低，且炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)水平降低，同樣提示其機制可能與抑制炎性反應有關，且MAPK信號通路在其中有重要作用。還有研究[19]發現，腦缺血再灌注經氟比洛芬酯處理后，環氧酶-2(COX-2)及p38 MAPK蛋白表達下調，并認為其機制可能是氟比洛芬酯抑制了p38MAPK信號通路，下調了COX-2表達，從而減輕炎癥反應。腦缺血再灌注后，在炎癥反應介導下一些炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1等激活p38 MAPK信號通路，導致內皮細胞、基底膜、星形膠質細胞的細胞膜的脂溶性改變，血腦屏障通透性增加，引起腦水腫和神經元損傷。氟比洛芬酯是一種非甾體類消炎藥，通過抑制p38 MAPK信號通路，并進一步抑制COX-2，阻斷花生四烯酸轉化為前列腺素，減少炎癥細胞因子生成，減輕了腦缺血再灌注后的炎癥反應以及氧化應激，進而保護神經功能。

綜上所述，氟比洛芬酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，保護血腦屏障功能，機制可能與抑制MAPK信號通路、下調p38 MAPK表達有關，可為氟比洛芬酯血腦屏障保護作用的機制研究提供參考。