HPLC法對(duì)阿侖膦酸鈉成分的測(cè)定

魏麗英,李景欣

(福建省廈門市中醫(yī)院,福建 廈門 361000)

阿侖膦酸鈉的英文名為Alendronate[1],作為第三代的雙膦胺類藥物能夠很好的治療骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤等,主要針對(duì)于高鈣血癥進(jìn)行治療。一般來說,阿侖膦酸鈉的分子結(jié)構(gòu)有兩個(gè)膦銨基團(tuán),十分容易進(jìn)行電離,在高效液相色譜法上難以進(jìn)行保留。在結(jié)構(gòu)上會(huì)出現(xiàn)無生色團(tuán),在檢測(cè)時(shí)難以使用常規(guī)儀器進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于阿侖膦酸鈉來說,常見的檢測(cè)方式為酸堿定位滴定法、離子交換色譜法等等。隨著社會(huì)的高速發(fā)展,我國人口老齡化越來越嚴(yán)重,患有骨質(zhì)疏松的人也越來越多,由于骨質(zhì)結(jié)構(gòu)受到了破壞,降低了骨頭的抗壓性,十分容易出現(xiàn)骨折的疾病[2]。嚴(yán)重會(huì)造成全身骨折,多發(fā)于女性。經(jīng)過近幾年的不完全統(tǒng)計(jì),50歲以上有1/3的女性患有骨質(zhì)疏松。阿侖膦酸鈉能夠在一定程度上治療骨質(zhì)疏松以及防止骨質(zhì)疏松。

1 阿侖膦酸鈉的藥學(xué)成分

阿侖膦酸鈉作為一類骨代謝劑,化學(xué)名叫做4-胺基-1-羥基亞丁基。可以根據(jù)自身的特點(diǎn)進(jìn)入到骨質(zhì)當(dāng)中,當(dāng)藥物徹底釋放之后,能夠提高骨細(xì)胞的活性,防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。阿侖膦酸鈉是第三代的雙膦胺類藥物,效果比第一代Etidronate藥物和第二代Pamidronate都強(qiáng)[8],在上個(gè)世紀(jì)末在美國被正式納入骨質(zhì)疏松治療用藥。該藥主要是由碳、氫、水、鈉、氮和磷所組成,其化學(xué)式為C4H12NaNO7P2-3H2O。

2 實(shí)驗(yàn)

阿侖膦酸鈉在合成的過程中主要是將Y-氨基丁酸進(jìn)行水解,將水解后的產(chǎn)物與亞磷酸進(jìn)行縮合。早在上個(gè)世紀(jì)末期,美國學(xué)者就開展了阿侖膦酸鈉的合成方法。以Y-氨基丁酸為原料進(jìn)行合成,包括氯苯法、熔融法、甲磺酸法等等。譬如在氯苯法當(dāng)中,將氯苯當(dāng)做溶劑,對(duì)Y-氨基丁酸進(jìn)行水解,將水解后的產(chǎn)物與亞磷酸等進(jìn)行縮合,從而得到阿侖膦酸鈉。熔融法是美國學(xué)者Giorgio Stsibano在上世紀(jì)中期所提出的,需要Y-氨基丁酸、亞磷酸進(jìn)行反應(yīng),不要任何的溶劑。因?yàn)閬喠姿岬娜埸c(diǎn)與反應(yīng)溫度相似,可以將亞磷酸進(jìn)行熔融,隨后在加入一些Y-氨基丁酸,從而得到液態(tài)的混合物,最后在加入三氯化磷等磷酰化物,整體呈酸性,在經(jīng)過一系列的操作,包括過濾、水解等等,就可以得到阿侖膦酸鈉結(jié)晶。在這個(gè)過程中,反應(yīng)率需要到70%。我國學(xué)者在上世紀(jì)末也在此基礎(chǔ)上,對(duì)熔融法進(jìn)行了加工,在得到4-胺基-1-羥基亞丁基之后,調(diào)節(jié)其中的pH值,從而得到單鈉鹽三水合物。熔融法最突出的特點(diǎn)就是不需要溶劑就可以得到阿侖膦酸鈉,并且在水解之后,就能得到阿侖膦酸鈉的結(jié)晶,整體的操作步驟比較簡(jiǎn)單,含阿侖膦酸鈉成分較高。唯一的缺點(diǎn)就是不能投入生產(chǎn),無法提高產(chǎn)能。

2.1 儀器和試藥

儀器：DIONEX液相色譜儀,UVD170U紫外線檢測(cè)器。

試藥：阿侖膦酸鈉藥片(石藥集團(tuán),規(guī)格：10mg,批號(hào)007110401),9-基甲基氯甲酸酯進(jìn)口試劑,將甲醇作為色譜純。

2.2 色譜條件

色譜柱：PLRP-S 100A(4.6mm×250mm,8um)；緩沖鹽(14.7g檸檬酸鈉,7.05g磷酸氫二鈉),在水中進(jìn)行溶解,調(diào)節(jié)pH值為8.0,檢測(cè)其中的波長,266nm,流速為1.0mL/min。

實(shí)驗(yàn)溶液：選擇阿侖膦酸鈉10mg的細(xì)粉,使用稀釋液的過程中,取29.4g的檸檬酸鈉,將其溶解在水中,配置成20μg/mL的溶液,繼續(xù)將其過濾。隨后取50mL中含有5mL的硼酸鹽溶液,具體步驟為取硼砂18g,將其加入水中并且稀釋,加入5mL的9-基甲基氯甲酸酯溶液,搖30s左右,并在恒溫條件下放置30min,加入25mL的二氯甲烷,等充分溶解后,就可當(dāng)做實(shí)驗(yàn)溶液。

對(duì)照溶液：需要選取適量的阿侖膦酸鈉對(duì)照組,并將其配置成20μg/mL的溶液,使用相同的方法制成5mL的對(duì)照品溶液。

2.3 檢測(cè)波長

使用對(duì)照溶液,通過照分光光度法,在儀器上進(jìn)行掃描,波長范圍在200～400nm之間,在266nm時(shí),檢測(cè)到的紫外線吸收最強(qiáng),所以選擇266nm作為檢測(cè)的波長。

2.4 空白輔料實(shí)驗(yàn)

使用空白輔料來形成空白輔料的溶液,使用實(shí)驗(yàn)溶液和對(duì)照溶液在空白輔料上通過色譜條件進(jìn)行分析,并在DIONEX液相色譜儀上進(jìn)行分析,對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄。詳見圖1,圖2。

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 試驗(yàn)品HPLC色譜圖

2.5 精密度測(cè)定

對(duì)照溶液的濃度為21μg/mL,將藥品放入儀器中,得到的結(jié)果是RSD為0.61,精密度要求基本符合。

2.6 樣品含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

規(guī)格為10g的三種樣品,批號(hào)分別為007110201,007110401,007111001；70g三種樣品,批號(hào)分別為152110501,152110801,152111001,通過HPLC以及原紫外法對(duì)其進(jìn)行分析,并在國家藥監(jiān)局頒布的最新標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果基本一致。

3 討論

高效液相色譜法(HPLC)主要通過高壓系統(tǒng),將性質(zhì)不同的溶劑放入固定相的色譜柱當(dāng)中,并且當(dāng)溶劑中的各個(gè)成分分開,使用檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在很多行業(yè)當(dāng)中都有所應(yīng)用,譬如化學(xué)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)。該方法的具有以下五個(gè)特點(diǎn)：①高壓,一般會(huì)以流動(dòng)的液體為載體,在色譜柱當(dāng)中有較大的阻力,為了保證色譜柱的正常運(yùn)行,必須對(duì)其使用高壓；②高效,對(duì)于所測(cè)定液體的分離效率較高；③靈敏度較高,通過紫外檢測(cè)器能夠分離到0.01mg,具有較高的準(zhǔn)確性；④應(yīng)用的范圍較廣,一般的有機(jī)化合物都可以使用高效液相色譜法進(jìn)行分析；⑤速度較快,相較于傳統(tǒng)的色譜法來說,高效液相色譜法有著更快的載體流速。至少可以節(jié)省十分鐘以上的時(shí)間。本文通過高效液相色譜法對(duì)阿侖膦酸鈉進(jìn)行分析,阿侖膦酸鈉是一種骨代謝調(diào)節(jié)劑,與人體骨頭當(dāng)中的羥磷灰石有著很親密的作用,能夠增加破骨細(xì)胞的活性,降低骨轉(zhuǎn)換率,并且促進(jìn)骨細(xì)胞的吸收。在臨床上主要是用于治療骨質(zhì)疏松或者防止骨質(zhì)疏松。在研究中表明,高效液相色譜法對(duì)于阿侖膦酸鈉的成分測(cè)定有著較高的檢測(cè)效率,并且符合我國的基本標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述,高效液相色譜法對(duì)于阿侖膦酸鈉有著較高的檢測(cè)價(jià)值,受到外部因素的影響較少,有一定的臨床價(jià)值。