溫腎強骨丸對脾腎陽虛型骨質疏松癥大鼠骨轉化指標的影響?

鄧 強，王雨榕，李中鋒，彭冉東，李軍杰，徐浩軍

1 甘肅省中醫院脊柱骨二科,甘肅 蘭州730050；2 甘肅中醫藥大學

骨質疏松癥是目前老年人群主要罹患的疾病之一，西醫學治療方法較為單一，臨床研究發現，中醫藥防治骨質疏松癥具有獨特優勢，本病屬中醫學“骨痿”“骨枯”等范疇，主要與腎、肝、脾3 臟功能有關，其中腎精虧虛是發病的基本病機，近年多數醫家從溫補脾腎入手治療本病取得了良好療效。骨質疏松癥和脾腎陽虛中醫證型造模方法種類多樣，骨質疏松癥造模方法主要包括去勢型、藥物誘導型、失用誘導型、飲食誘導型、基因敲除型、自然退變型等［1］，其中去勢型造模方法具有模型穩定、可操作性強、可信度高，經濟適用等特點，應用廣泛。腎陽虛造模方法有注射氫化可的松、灌胃腺嘌呤、切除性腺等［2］；脾陽虛造模方法主要包括番瀉葉/大黃灌胃、飲食失節、勞倦過度等。根據其病因病機，采用番瀉葉灌胃+飲食失節+勞倦過度方法聯合造模可更好模擬人類脾腎陽虛發病機制。本研究通過建立脾腎陽虛型骨質疏松癥大鼠模型，觀察各組大鼠骨轉化指標變化情況，進一步探討溫腎強骨丸防治脾腎陽虛型骨質疏松癥的作用機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠70 只，雌性，體質量（220±20）g，購自甘肅中醫藥大學SPF 級實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（甘）2015-0005。實驗動物喂養于甘肅中醫藥大學動物實驗中心（SPF 級），普通大鼠顆粒飼料喂養，飲用水為高壓滅菌自來水。環境溫度4～18℃，光照時間7∶OO AM～7∶OO PM，暗室時間7∶OO PM～7∶OO AM，空氣濕度45%～65%。

1.2 試劑與藥品抗酒石酸堿性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0620R2）；大鼠尿Ⅰ型膠原交聯N 末端肽（type I collagen cross linked N telopeptides in urine，U-NTX）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-1056R2）；骨堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，BLAP）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0619R2）；雌二醇（estradiol，E2）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0575R2）；尿型膠原交聯C 末端肽（C-terminal telopeptides of type I collagen，U-CTX)、試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-1037R2）；骨鈣蛋白（osteocalcin，BGP)試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0700R1）；氫化可的松注射液（紫光古漢集團衡陽制藥有限公司，國藥準字H43021210，規格：2 mL∶10 mg）；番瀉葉（購自甘肅省中醫院中藥藥房）；溫腎強骨丸（甘肅省中醫院，批號：20180926，規格：40 g/瓶）；阿侖膦酸鈉（杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20130085，規格：70 mg/片）；甘藍、精煉豬油自備，蒸餾水、生理鹽水、10%水合氯醛、10%甲醛溶液、苦味酸等由甘肅中醫藥大學實驗中心提供。番瀉葉為100%水煎液。

1.3 儀器L600 型臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Benchmark aaPlus 型連續波長酶標儀（美國BIO-RAD 公司）；Q5000型紫外分光光度計（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；NW10VF 型超純水系統（力康生物醫療科技控股有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模 將大鼠適應性飼養后隨機分為正常組、假手術組、模型組、西藥組（阿侖膦酸鈉）及溫腎強骨丸高、中、低劑量組，除正常組外，其余各組大鼠采取去勢法（切除雌性SD 大鼠雙側卵巢）+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節+勞倦過度方法造模：大鼠禁食12 h 后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），麻醉起效后剔除兩側腹部皮毛，用75%酒精消毒，在雙側肋下1～1.5cm處縱形切開入腹，結扎雙側卵巢動脈，切除雙側卵巢及周圍脂肪，逐層縫合［3］。假手術組只暴露雙側卵巢，不做切除。去勢術后第2天開始，每日上午9時用100%番瀉葉水煎液灌胃，每只2 mL，正常組與假手術組灌胃等量生理鹽水；每日下午3 時將大鼠置于38℃恒溫水浴中游泳至疲勞（疲勞標準為全身下沉至沒頸，不能堅持游泳）；單日喂飼甘藍每只10 g，雙日喂精煉豬脂每只2 mL，正常組與假手術組予普通鼠糧，期間各組均自由飲水［4］，大鼠術后1周開始肌肉注射氫化可的松注射液（2 mL∶10 mg）5 mg/kg，假手術組肌肉注射等量生理鹽水，每周4次。

1.4.2 干預方法 造模8 周，確定骨質疏松動物模型成功后溫腎強骨丸高、中、低劑量組按人、鼠體型系數折算為成人等效劑量（生藥含量分別為1.72、0.86、0.43 g/kg，并以每千克體質量20 mL蒸餾水稀釋，制成混懸液灌胃），每日1 次；正常組和模型組灌胃等劑量生理鹽水；西藥組按人鼠等效劑量給予阿侖膦酸6 mg/kg，每周1次，持續灌胃8周。

1.5 血清骨轉化指標測量所有動物干預8 周后禁食水12 h，腹腔麻醉后心臟取血4 mL，嚴格按照試劑盒說明書運用酶聯免疫吸附法檢測TRAP、U-NTX、BLAP、E2、U-CTX、BGP 等骨轉化指標，其質量濃度按說明制作各自標準曲線，計算樣品中的含量。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般活動造模期間，第1～3 周各組大鼠一般狀態比較基本無差異；第4 周，模型組大鼠活動較正常組及假手術組減少，開始出現毛發無澤、掉毛現象，爪甲顏色較淺，大便較稀軟；第5 周，模型組大鼠出現大便清稀，甚者如水狀，爪甲顏色變淡，毛發枯萎無華，尾巴涼，弓背倦怠，喜扎堆；第6～8周，模型組大鼠上述狀態較第5周更甚，且飲食、飲水量低于空白組，游泳持續時間為正常組的1/2，表明模型組大鼠體力、能量代謝較正常大鼠組及假手術組大鼠降低。溫腎強骨丸干預后第1～2 周，與模型組相比，溫腎強骨丸各劑量組大鼠一般情況基本無明顯差異；第3～4 周，溫腎強骨丸各劑量組大鼠活動較模型組明顯增多，掉毛明顯減少，扎堆現象有所改善，大便仍清稀；第4～6周，溫腎強骨丸各劑量組大鼠無扎堆現象，毛發色澤明顯改善，尾巴溫度恢復正常，大便稀軟但成形，大便量較多；第7～8 周，與模型組相比，溫腎強骨丸各劑量組大鼠大便質地恢復，無便溏癥狀，飲食、飲水量恢復正常，活動明顯增多，脾腎陽虛癥狀明顯改善。

2.2 骨代謝指標與正常組和假手術組比較，模型組大鼠BALP、E2含量降低（P＜0.05），BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和溫腎強骨丸各劑量組BALP、E2含量均增高（P＜0.05）；BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX 含量均下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（±s）

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與溫腎強骨丸低劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組假手術組溫腎強骨丸高劑量組溫腎強骨丸中劑量組溫腎強骨丸低劑量組阿侖膦酸鈉組鼠數8 8 8 8 8 8 8 BGP（ng/L）194.59±14.91 231.50±40.25*168.68±17.06 179.42±19.27#△186.69±21.38#181.46±16.20#173.63±31.48#TRAP（pg/mL）625.07±158.43 933.72±53.09*703.40±244.26 828.38±58.16#△830.61±52.49#819.60±52.49#824.28±62.89#U-NTX（nmol/L）3.95±0.56 4.86±0.71*4.31±0.95 3.71±0.88#△4.40±1.82#3.97±1.44#3.90±0.89#U-CTX（μg/L）0.28±0.62 0.41±0.22*0.34±0.20 0.34±0.20#△0.40±0.10#0.32±0.20#0.39±0.70#BALP（μg/L）4.02±2.91 1.91±1.41*3.53±2.57 2.40±1.52#△2.51±1.34#2.90±0.49#2.10±0.54#E2（ng/L）19.61±0.52 16.72±1.78*17.57±2.97 21.32±1.19#△19.90±1.82#17.31±1.39#25.19±1.95#

3 討論

骨質疏松癥的治療臨床常用藥物主要有抗骨吸收藥物和促骨形成藥物兩類，但由于長期用藥副作用較大、患者經濟壓力大等缺點，使得中醫藥治療骨質疏松癥的獨特優勢成為研究熱點［5-6］。近年來，隨著分子生物學的發展，從基因調控水平證實中醫藥治療骨質疏松癥的作用機制，為中醫藥靶向治療提供了科學依據。

中醫藏象理論認為，腎“主骨生髓”，主人體生長發育，為“先天之本”，受“后天之本”脾臟運化的水谷精微充養，因此人體骨骼的生長發育與脾腎密切相關，且在骨質疏松癥的中醫證型研究中，有學者發現脾腎陽虛證是骨質疏松癥的主要證型［7］。臨床研究證實補腎健脾方藥治療脾腎陽虛型骨質疏松癥有顯著療效，如潘永苗等［8］用補腎健脾通絡湯治療骨質疏松癥，發現其能提高患者骨密度，減輕患者癥狀。王巖等［9］在口服鈣爾奇（碳酸鈣D3）片、羅鈣全（骨化三醇丸）的基礎上加用補腎健脾益氣方（茯苓9 g，白術9 g，陳皮9 g，人參6 g，生地黃6 g，枸杞子30 g，麥門冬15 g）治療脾腎氣虛型老年骨質疏松癥取得了良好療效。黃琳玲等［10］采用自擬益腎健脾化瘀方治療絕經后脾腎陽虛型骨質疏松癥，發現該方可改善臨床癥狀，提高患者骨密度。

BALP 是成骨細胞的一種細胞外酶，BALP 的增殖、分化和成熟與骨骼正常生長發育密切相關，骨骼礦化受阻時，成骨細胞合成大量堿性磷酸酶，使血清BALP 明顯升高。骨特異性堿性磷酸酶參與骨形成過程，在血清中穩定，是成骨細胞成熟和具有活性的標志［11］。BALP 被認為是最精確的骨形成標志物之一。血清BALP 定量測定與動態觀察對骨代謝疾病，特別是骨質疏松癥的早期診斷、治療效果監測、病情預后判斷等提供有效依據。BGP是反映骨形成的特異性生化指標，不僅參與骨吸收調節，更重要的是參與基質礦化過程及成骨細胞分化，與骨轉換相關，能維持骨正常礦化速率，抑制軟骨礦化速率，并抑制骨異常羥磷灰石結晶形成［12］。因此，BGP 通常被認為是反映骨形成的生化指標。TRAP 作為第2 代骨吸收標志物，是有特異和高敏感度的骨吸收指標［13］。在骨的有機質中，90%為Ⅰ型膠原，NTX 與CTXI 水平均能反映破骨細胞骨吸收活性［14］，是骨吸收的重要生化標志物［15］，其升高程度與破骨細胞活性增高程度一致，可靈敏反映骨代謝變化，是評價骨形態計量學骨吸收的重要參數［16］。研究［17］發現，NTX與CTX 是骨代謝的敏感指標，與骨密度改變、骨折發生具有相關性，其增加可提示骨關節炎患者骨量減少。

溫腎強骨丸是甘肅省中醫院脊柱骨二科經驗方藥，由淫羊藿、骨碎補、枸杞子和丹參等7 味中藥組成，具有溫腎強骨、活血通絡功效，臨床用于治療脾腎陽虛型骨質疏松癥取得良好效果，因此，本實驗基于臨床療效觀察研究其對脾腎陽虛型骨質疏松癥大鼠的防治作用，為臨床廣泛運用提供實驗依據。本實驗采取去勢（切除大鼠卵巢）+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節+勞倦過度方法制造脾腎陽虛型骨質疏松癥大鼠模型，病癥相結合，更好地模擬人類發病機制，結果顯示，模型組大鼠BALP、E2含量降低，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和溫腎強骨丸方各組BALP、E2均增高，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量均下降。

綜上所述，溫腎強骨丸改善了脾腎陽虛型骨質疏松大鼠的骨代謝生化指標，表明溫腎強骨丸對脾腎陽虛型骨質疏松有一定防治作用，但是其藥動學仍需進一步研究，并且其作用機制不明確，未來可基于骨質疏松癥發生的信號通路進一步深入研究其對骨代謝影響的作用機制，為溫腎強骨丸的廣泛臨床應用提供研究基礎。