溪黃草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究?

馬鵬文，師慶媛，朱昱瀾，任一杰，2△

1 甘肅省中藥固體分散制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司，甘肅 蘭州730102；2 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

溪黃草在南方各地應(yīng)用普遍，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，可用于治療濕熱黃疽、濕熱瀉痢、癮閉、跌打疲腫等疾病［1］。隨著中藥發(fā)展及中成藥生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，溪黃草的應(yīng)用也越來越廣泛。消炎利膽片、膽石通膠囊中均以溪黃草作為主要原料，但《中華人民共和國藥典》2015年版一部藥材項(xiàng)下未收載溪黃草藥材品種［2］，現(xiàn)行質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為地方標(biāo)準(zhǔn)［3-4］。各地方標(biāo)準(zhǔn)中溪黃草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)均未制定定性指標(biāo)和含量測(cè)定指標(biāo)。為此，本研究采用薄層色譜法檢測(cè)溪黃草中迷迭香酸成分，采用HPLC法測(cè)定齊墩果酸、熊果酸含量，以期為溪黃草藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器AX204 萬分之一電子天平（上海梅特勒公司）；MS205DU 十萬分之一電子天平（上海梅特勒公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SB25-12DTD 數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TU1901 紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；Waters 152高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 試劑迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201706）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-201607）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-201622）均購于中國食品藥品檢定研究院。銀龍牌硅膠G 薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；甲醇、乙腈、乙酸銨為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)中10 批溪黃草藥材為單位藥材供應(yīng)商提供，產(chǎn)地分別為安徽、廣東、廣西、河南，依次編號(hào)1～10。

2 方法與結(jié)果

2.1 迷迭香酸薄層鑒別取溪黃草藥材粉末2.0 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min（功率500 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取迷迭香酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μL，甲醇作為空白溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，空白無干擾。因該方法操作簡(jiǎn)便、快速，斑點(diǎn)顯色清晰，確認(rèn)該方法可用于溪黃草藥材中迷迭香酸的定性鑒別。薄層色譜圖見圖1。

圖1 溪黃草藥材中迷迭香酸薄層鑒別

2.2 齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18MGⅡ，以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨（67∶12∶21），等度洗脫；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取齊墩果酸及熊果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸80μg，熊果酸0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取溪黃草藥材粉末2.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 空白對(duì)照溶液 取提取溶劑甲醇作為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，齊墩果酸與熊果酸的分離度為1.59，理論板數(shù)以熊果酸計(jì)為7355，齊墩果酸與熊果酸保留時(shí)間分別為21.670 min和22.720 min。結(jié)果表明該方法專屬性好，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。見圖2—4。

圖2 齊墩果酸、熊果酸混合對(duì)照品

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下齊墩果酸、熊果酸混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定容，分別進(jìn)樣20μL，以峰面積值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：齊墩果酸回歸方程為：Y=1.09×104X-11 300，r＝0.9998，線性范圍：5.066-50.664 2μg/mL；熊果酸回歸方程為：Y=6.9×103X-8660，r=0.9998，線性范圍：9.735-97.352μg/mL。結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積RSD=0.7%，熊果酸峰面積RSD=0.6%。儀器精密度良好。

圖3 空白溶劑色譜圖

圖4 溪黃草樣品HPLC色譜圖

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液20μL，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h 時(shí)測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積的RSD=0.9%，熊果酸峰面積的RSD=0.5%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6 份供試品溶液，計(jì)算齊墩果酸含量為0.749 mg/g，RSD=1.2%，熊果酸含量為1.503 mg/g，RSD=0.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知齊墩果酸含量（齊墩果酸含量為777.197μg/g）的溪黃草樣品9份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液（齊墩果酸對(duì)照品382.389 μL/mL）0.8、1.0、1.2 mL 至50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算齊墩果酸的加樣回收率。取已知熊果酸含量（熊果酸含量為1.754 mg/g）的溪黃草樣品9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液（熊果酸對(duì)照品0.786 mg/mL）0.8、1.0、1.2 至50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算熊果酸的加樣回收率。見表1—2。

表1 齊墩果酸的加樣回收率（n=9）

表2 熊果酸的加樣回收率（n=9）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 選取10 個(gè)批次的溪黃草樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量（按干燥品計(jì)），結(jié)果見表3。

表3 齊墩果酸與熊果酸含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討論

溪黃草中含有齊墩果酸和熊果酸，其中熊果酸具有體外抗乙肝病毒的作用［5-6］。近年來對(duì)溪黃草藥材中化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究文獻(xiàn)［7-9］眾多，相關(guān)文獻(xiàn)［10-11］中分別檢測(cè)溪黃草中迷迭香酸、齊墩果酸及熊果酸含量，但不同品種間迷迭香酸含量差異較大，無法統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［12-13］；溪黃草藥材不同品種間齊墩果酸和熊果酸含量差異小于迷迭香酸，故選擇迷迭香酸為定性鑒別的檢查指標(biāo)，齊墩果酸和熊果酸為含量控制指標(biāo)。

TLC 實(shí)驗(yàn)中分別選擇環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸（15∶3∶3.5∶1）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶3∶0.2）、甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，對(duì)迷迭香酸的展開條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑時(shí)展開效果最好；另選用乙醇、70%乙醇、甲醇作為提取溶劑，結(jié)果以甲醇作為提取溶劑時(shí)展開效果最好。

根據(jù)資料［14-15］探索齊墩果酸、熊果酸含量的檢測(cè)條件。對(duì)樣品的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，包括提取方法、提取時(shí)間、溶劑選擇等，分別對(duì)比了甲醇超聲提取、回流提取、索氏提取45 min 的提取效果，結(jié)果超聲45 min提取的齊墩果酸、熊果酸含量最高；同時(shí)對(duì)比超聲15、30、45 min時(shí)的提取效果，結(jié)果超聲30 min 和超聲45 min 時(shí)齊墩果酸、熊果酸含量差異不大，故選擇超聲30 min；溶劑選擇考察了70%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇的提取效果，結(jié)果用甲醇提取時(shí)效率最高。