高效液相色譜法測(cè)定射麻口服液中黃芩苷含量

楊巧虹 ，鄧開英 ，申麗莎

（1. 重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶 401147； 2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121； 3. 重慶市中藥研究院，重慶 400061）

射麻口服液由黃芩、麻黃、膽南星、射干、醋五味子等10 味藥材提取制成，具有清肺化痰、止咳平喘功效，臨床主要用于外邪犯肺、入里化熱所致咳嗽、痰多稠黏、胸悶憋氣、氣促作喘、喉中痰鳴、發(fā)熱或不發(fā)熱、舌苔黃或黃白、或舌質(zhì)紅、脈弦滑或滑數(shù)等證，效果良好［1］314。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，用于胸悶嘔惡、濕熱痞滿、肺熱咳嗽等［1］1469，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)其進(jìn)行含量控制。本研究中參考文獻(xiàn)［2 －14］，建立了測(cè)定射麻口服液中黃芩所含有效成分黃芩苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，為其質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫儀器公司）；BP211S 型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）；Simplicity－185 型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為171241 －201508，含量為 93.3% ）；射麻口服液（海南中盛合美生物制藥有限公司，批號(hào)分別為20190102，20190301，20190401，規(guī)格為每支 10 mL）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －0.2% 磷酸溶液（47 ∶53，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液的黃芩苷色譜峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度良好，且陰性對(duì)照無干擾，分離度大于1.5，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)不低于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1. baicalinA. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取黃芩苷對(duì)照品0.011 23 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取射麻口服液適量，混勻，精密量取1 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例和制備工藝制備不含黃芩的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液 1，5，10，15，20 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝3 693.4 X － 5.843 3，r ＝ 0.999 9（ n ＝ 5）。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.041 91 ～ 0.838 20 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 次，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的 RSD 為 0.63% （n ＝ 5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12 h 時(shí)各進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的 RSD 為0.58%（n ＝5），表明供試品溶液室溫下放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20190102）樣品適量，精密稱定，混勻，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行5 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芩苷含量的 RSD 為 0.84%（n ＝ 5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為 20190102）各 0.5 mL，共 6 份，分別置 25 mL 容量瓶中，分別加入一定量的黃芩苷對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of baicalin（n ＝ 6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品 3 批（批號(hào)分別為 20190102，20190301，20190401），按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中黃芩苷的含量分別為12.46 g ／L，11.08 g ／L，12.41 g ／L。

3 討論

參考文獻(xiàn)［2－14］，考察了不同流動(dòng)相甲醇－水－磷酸溶液（47 ∶53 ∶0.2，V ／ V ／ V）、甲醇 － 0.2% 磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.2%磷酸溶液、甲醇－0.1%甲酸溶液、乙腈－0.1%甲酸溶液對(duì)黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果的影響。甲醇比乙腈的毒性小，價(jià)格便宜，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用試劑，故參照2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》黃芩藥材含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件，即色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇 － 水 － 磷酸溶液（47 ∶53 ∶0.2，V ／ V ／ V），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。本研究中將流動(dòng)相簡(jiǎn)化為甲醇－0.2%磷酸溶液（47 ∶53，V ／ V），檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm。經(jīng)試驗(yàn)考察，于280 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)，以甲醇－0.2%磷酸（47 ∶53，V ／ V）為流動(dòng)相，射麻口服液中黃芩苷分離效果良好，且陰性對(duì)照無干擾。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，供試品溶液中黃芩苷色譜峰與黃芩苷對(duì)照品溶液色譜峰紫外光譜圖一致。

考察供試品溶液制備方法時(shí)，取樣品，分別加入70%乙醇、甲醇稀釋，結(jié)果加入70%乙醇時(shí)樣品中未見沉淀產(chǎn)生，加入甲醇則產(chǎn)生了大量沉淀，沉淀后的溶液顏色明顯變淺，故制備供試品溶液時(shí)采用甲醇，以沉淀的方式除去雜質(zhì)。

本研究中采用了2 個(gè)不同品牌的色譜柱和2 個(gè)不同廠家的液相色譜儀對(duì)供試品溶液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果黃芩苷色譜峰均達(dá)到基線分離，色譜效果和含量測(cè)定結(jié)果一致，表明方法耐用性良好。