GYS2與p53抑制HBV相關肝癌的研究

趙新軍，李 循，王書恒，李九智

(1.伊犁師范大學新疆凝聚態相變與微結構實驗室，伊寧 835000；2.伊犁師范大學微納電傳感器技術與仿生器械實驗室，伊寧 835000；3.新疆維吾爾自治區人民醫院泌尿外科，烏魯木齊 830000)

1 引 言

乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)常誘發肝癌(HCC)，HBV或HCV感染后造成肝細胞基因改變，引起肝臟病變，誘導HCC的發生發展[1-3].流行病學調查表明[3]，HCC的發生多半與乙肝病毒x蛋白(HBx)引發的炎癥和代謝異常密切相關.新興的證據也表明[4，5]，葡萄糖代謝異常已經成為了癌癥的重要標志之一.糖原是葡萄糖的支鏈聚合物，存儲于肌肉和肝臟中，可在需要時用于能量供應[6，7].近來的研究發現[8-10]，在人類腫瘤細胞中存在異常的糖原含量，例如，在低糖原組織(如乳房，卵巢，腎和肺)癌細胞中的糖原含量增加，而在HCC細胞中，糖原濃度與肝臟腫瘤生長呈負相關.另外，由于糖原解支酶AGL的喪失，導致的糖原減少，還會誘導膀胱癌的發生[11].

糖原合酶(GS)是糖原合成中的關鍵酶，GS在人體組織中有兩種同工型，糖原合酶1(GYS1)和糖原合酶2(GYS2)[12].諸多的研究證據表明[13，14]，GYS1通常在肌肉、心臟和腎臟中表達，而GYS2的表達則主要限于肝臟中.作為糖原生物合成的限速酶，GS催化將UDP葡萄糖添加到現有的葡萄糖分子上，以延長線性葡萄糖聚合物鏈.研究表明[15]，在髓樣白血病細胞增殖過程中，GYS1不僅可以降低糖酵解通量，而且增加了糖原反應性AMPK(AMP激酶)的激活，從而顯著抑制白血病細胞生長.在肝臟糖原合成中，GYS2則起著重要的調控作用，研究發現[16-18]，GYS2可以刺激肝臟中糖原合成，有助于將血糖水平維持在一定范圍內，GYS2基因突變會引起糖原合酶缺乏癥.最近，Chen等人[19]的研究發現，在HCV誘發HCC進程中，GYS2與p53協同限制HCC細胞生長和增殖，GYS2的敲減則會調低p53的表達，促進HCC細胞生長增殖.在HCV誘發的HCC進程中，GYS2被糖原合酶激酶3β(GSK3β)磷酸化和抑制，被6-磷酸葡萄糖(G6P)變構激活[20，21]，并在肝糖原合成的晝夜節律中由CLOCK基因調控轉錄[22].

p53蛋白是細胞內最重要的腫瘤抑制因子之一[23]，在響應應激信號的過程中，p53介導細胞對多種遺傳毒性和生長脅迫作出反應，包括DNA損傷和致癌性侵害.激活的p53可以增加許多基因的表達，并引發細胞暫時的細胞分裂周期停滯，永久性細胞衰老和凋亡性細胞死亡，以防止受損或受壓的細胞繼續增殖.通常認為，逃避p53介導的檢查點途徑是大多數(不是全部)腫瘤類型發展的必要步驟[24，25].同樣重要的是，在膠質母細胞瘤、乳腺癌和結腸癌細胞中，p53可以通過誘導糖原蓄積的方式，抑制細胞過早衰老和腫瘤生長[26].在HCV誘發HCC進程中，p53通過帶有GYS2的負反饋回路，限制HBV相關的HCC細胞生長增殖[19].

深刻理解GYS2與p53協同作用，抑制HBV相關的HCC基因表達的信號通路，對于設計阻止HBV引起的HCC治療方案是非常重要的.實驗研究結果[19，26]為糖原代謝失調誘發的HCC臨床治療提供了新的治療靶點.之前的理論[27-32]在激活基因通路研究方面已經取得了重要的成果，并定量揭示了腫瘤抑制的物理機制.在GYS2與p53協同作抑制HBV相關的HCC進程中，HBx、HDAC1與乙酰化的p53(p53AC)形成復合體，并抑制GYS2表達；GYS2通過調控增強p53蛋白的穩定性，抑制HCC的發生發展[19].p53已被證實了在抑制癌變過程中起著重要的作用[23-26].那么，GYS2與p53是如何協同調控HBV相關的HCC的發生發展，當前仍然沒有相關理論或模擬研究揭示其深刻的物理機制，在HBV誘導HCC的發生發展過程中，糖原代謝的改變和潛在的分子機制仍然未知.

鑒于文獻[19]中新穎而重要的實驗結果，在本文中，將建立動力學理論模型，研究GYS2與p53抑制HBV相關的HCC進展的動力學機制，分析GYS2與p53的調控作用，進一步深刻揭示GYS2與p53調控HBV相關的HCC的抑癌機理，為設計阻斷乙型肝炎向HCC轉變的通路治療方案提供理論依據.

2 理論模型

Chen等人的實驗研究發現[19]，GYS2與p53通過負反饋抑制HBV相關的HCC進程中，HBx、HDAC1與p53AC形成復合體，抑制GYS2表達；抑制HBx/HDAC1/p53AC復合物形成，則會支持GYS2的轉錄.GYS2與MDM2蛋白競爭結合p53，分別與p53形成復合體.同時，GYS2與MDM2競爭性地與p53結合，也阻止了p53介導的MDM2的泛素化和降解.MDM2也通過抑制p53的反式激活活性來抑制p53的功能[27].基于以上考慮，GYS2與p53抑制HBV相關的肝癌進展的具體模型示意圖為：

圖1 GYS2與p53抑制HBV相關的肝癌進展的具體模型示意圖.Fig.1 Schematic depiction of the model on GYS2 and p53 inhibiting the progression of HBV-related hepatocellular carcinoma.

在這里，我們描述HBx、HDAC1與p53AC形成復合體HHP，這一復合體抑制GYS2表達.GYS2和MDM2競爭與p53結合，與GYS2和MDM2結合的p53標記為Gp53和Mp53.Gp53、Mp53分別和GYS2、MDM2形成的復合體為GYGP、MPMD.假定形成復合體HHP的反應為三級反應，形成其余復合體的反應為二級反應.復合體GYGP誘導p53形成穩態的p53(Sp53)，與p300結合的Sp53標記為PSp53，p300通過與PSp53形成的復合體為pp53，并將PSp53乙酰化為p53AC.未與p300結合的Sp53標記為FSp53，FSp53抑制HCC的發生發展.基于Hill動力學與Michaelis-Menten方程[33，34]，可以獲得各組分濃度隨時間變化的動力學方程組為：

以上方程組中，k3、k4為競爭因子參數，為了符合實驗結果[19]，我們模型化k3=1/{1+exp[0.5(1-[GYS2]/[MDM2])]}，k3、k4描述了GYS2和MDM2對p53的競爭結合能力，其中：k4=1-k3.k10=?1/{1+exp[0.3(1-[p300]/[Sp53])]}描述了p300對Sp53的結合能力，k11=1-k10，標記未與p300結合的Sp53的分數，方程(5)中的Hill系數為n=3.GYS2通過與p53協同作用而起到抑癌作用，在這里我們考慮FSp53抑制HCC的發生發展.

生物系統具有很強的穩定性，這使得合理的數學模型能夠在很大的參數范圍內有效描述系統的特性，可以通過考察模型對參數變化的敏感性檢測參數(如附錄中附表所示)設置的合理性，模型中微分方程組可以通過四階Runge-Kutta方法求解.

3 結果與討論

Chen等人的實驗結果表明[19]，GYS2通過與p53結合，致使Sp53形成，FSp53抑制HCC的發生發展.為了深刻揭示GYS2與p53協同抑癌作用，取各參數值(如附錄中附表所示)，可以獲得并分析[HBx]=0.2 μM時[Sp53]、[FSp53]隨[GYS2]的變化關系.

圖2 顯示了[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]變化的函數關系.從圖2可以看出，在較小的[GYS2]范圍內，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的增大而顯著增加.[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的變化呈現了相似的變化規律，由此表明了[FSp53]與[Sp53]的正相關性，Sp53表達水平的提升會促使FSp53表達水平幅度提高.如圖2所示，在起始的GYS2濃度變化范圍內(0.04～0.1 μM)，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的變化較為緩慢，當GYS2達到較高濃度時(0.12～0.16 μM)，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的增加較快增長.由此表明，少量的GYS2的增加即可促使Sp53的表達上調，進而FSp53的表達水平隨著Sp53表達水平的提升而增大.當GYS2濃度達到較高時(0.12～0.16 μM)，這會促使Sp53和FSp53的表達上調加快.由此可以確定，Sp53和FSp53的活性可以由GYS2靈敏地調控.GYS2調節提升了Sp53表達水平，激活并促進下游FSp53的表達提升，抑制HCC的發生發展.相反，如果GYS2敲減，會使得Sp53表達下調，進而降低FSp53表達水平，HCC發生發展的抑制程度減弱.Chen等人的實驗結果[19]已經揭示，在HCV誘發的HCC進程中，由于GYS2的缺失，在很大程度上促進了HCC細胞的生長.

圖2 [Sp53]與[FSp53]隨[GYS2]的變化關系Fig.2 [Sp53]and[FSp53]as a function of[GYS2]

通過RNA測序進行的轉錄分析結果表明[19]，GYS2的敲減抑制了p53通路，通過GYS2和p53的直接結合，GYS2的過多表達誘導p53表達水平提升.同時，MDM2介導的p53泛素化被GYS2減弱，MDM2則通過抑制p53的反式激活活性來抑制p53的功能[27].為了揭示MDM2介導的p53的潛在抑制機制，可以考察[MDM2]的動力學特性和MDM2影響Sp53的特性.

k5參數描述了Sp53對MDM2的激活速率，改變k5可以獲得不同幅值的[MDM2]與[Sp53]隨時間改變的函數關系.圖3顯示了不同k5條件下，[MDM2]與[Sp53]隨時間改變的動力學關系.從圖3a可以看出，隨著時間的演化，[MDM2]極快地升高到了穩定值.并且，較大的k5對應了較大的[MDM2]隨時間變化的幅值.這是由于較大的k5代表了Sp53對MDM2較大的激活速率，因此使得MDM2表達水平幅值變大.這是由于MDM2由Sp53誘導激活，很快提升了表達水平，Sp53的高表達會促使MDM2表達水平提升.同時，激活的MDM2與p53結合，形成復合物MPMD抑制Sp53的功能.另外，GYS2和p53結合的復合物GYGP誘導Sp53水平提升.圖3b顯示了在不同k5(不同MDM2表達幅值)條件下，Sp53幅值水平只是輕微改變，由此表明了Sp53的穩態特性，這意味著GYS2在調控維持Sp53處于穩態、進而抑制HCC中起著重要作用.實驗的研究表明，MDM2通過與GYS2競爭性結合p53，抑制p53的泛素化而穩定了p53蛋白.部分穩定的p53蛋白(Sp53)經過p300乙酰化后，形成p53AC，并與HBx、HDAC1結合形成復合體HHP，抑制GYS2表達.

圖3 [MDM2]與[Sp53]隨時間改變的動力學關系Fig.3 Temporal evolutions of the levels of[MDM2]and[Sp53]

圖4 顯示了[HHP]隨[p53AC]變化的函數關系.從圖4可以看出，被p300乙酰化后的p53(p53AC)會導致HHP急劇增加.p53AC通過與HBx、HDAC1形成復合體HHC，這種復合體誘導GYS2表達水平降低.這樣，通過p300介導的p53乙酰化，形成了依賴于p300的負反饋回路抑制GYS2.Chen等人發現[19]，p53能夠轉錄調節糖原合成中涉及的基因，例如PYGL，GBE1，G6PC和GSK3β.在這里，p53AC的過多表達，則誘導HHP表達上調，抑制GYS2的表達水平，進而會調低細胞中的糖原含量.因此，這種p53的異位表達的敲低，則會上調GYS2，由此表明了GYS2在p53介導的異常糖原代謝中的作用[18，19].

圖4 [HHP]隨[p53AC]變化的函數關系Fig.4 [HHP]as a function of[p53AC]

除了p53AC通過與HBx、HDAC1形成復合體HHC，參與糖原代謝調節，Chen等人的數據也表明乙肝表面抗原(HBsAg)陽性HCC患者的GYS2會被進一步降低，為了進一步深刻理解HBx在糖原代謝中的作用，可以考察不同HBx濃度條件下GYS2與Fsp53的動力學特性.

圖5 呈現了在不同HBx濃度條件下，GYS2和FSp53濃度隨時間改變的動力學關系.從圖5a可以看出，在HBx處于較低濃度條件下，GYS2濃度經過較短時間升到了較大的穩定值，表明GYS2很快被激活并達到一定的表達水平.當HBx濃度較高時，GYS2很快升高到了最大值，然后持續極短時間后降低并趨于穩定.由于HBx與p53AC、HDAC1結合形成復合體HHP，較高濃度的HBx可以生成較多的HHP(圖5a插圖)，HHP通過負反饋抑制GYS2表達.由此表明，較高濃度的HBx誘發減弱了GYS2表達，使得GYS2表達下調，這種下調使得HBx弱化了下游FSp53的表達，促進了HCC的發生發展.圖5b呈現了隨著HBx濃度增大，FSp53隨時間改變的幅值降低.由此表明，HBx會促使FSp53的表達下調，這樣下調后的FSp53對HCC的抑制程度減弱，有利于HCC增殖.因此，在糖原代謝過程中，HBx與HDAC1、p53AC形成復合體，調控GYS2表達降低，進而使得FSp53表達下調，HCC細胞增殖加快.相反，敲低的HBx不能形成過多的HHP，有利于GYS2表達上調，在一定程度上恢復HCC細胞中的糖原含量，并且GYS2表達上調還可以促使FSp53表達水平提升，抑制HCC的發生發展.實驗研究也表明，HBx通過其120-134aa域抑制GYS2表達，在HepG2.2.15和HepG2-HBx細胞中，沉默的HBx會使得GYS2表達上調，在HBx陽性病例中，GYS2低表達更為常見[18，19].

圖5 不同[HBx]條件下，[GYS2]與[FSp53]隨時間改變的動力學關系Fig.5 Temporal evolutions of the levels of[GYS2]and[FSp53]at different[HBx]

在HCC的發生發展過程中，FSp53是最重要的抑制因子之一，p300與Sp53結合，調低了FSp53的表達水平，從而減弱了FSp53對HCC的抑制程度.

圖6 呈現了在不同p300濃度條件下，[pp53]與[FSp53]隨時間改變的動力學關系.從圖6可以看出，[pp53]與[FSp53]隨時間演化很快增加，并維持穩定值趨于不變，這表明pp53與FSp53很快會達到穩定的表達水平.比較圖中p300濃度在[p300]=0.2 μM，[p300]=0.7 μM和[p300]=1.2 μM時的[pp53]幅值，可以發現，隨著[p300]增大，[pp53]隨時間變化幅值明顯變大，這是由于，較多的p300有利于與Sp53形成較多的復合物pp53.過多pp53生成使得p53AC增多，p53AC協同HBx與HDAC1促使GYS2表達降低，形成了誘發HCC的負反饋通路.同時，與Sp53形成較多pp53，會消耗較多的Sp53，致使FSp53表達降低，從而導致FSp53對HCC抑制程度減弱，進而誘導HCC發生發展.

圖6 不同[p300]條件下，[pp53]與[FSp53]隨時間改變的動力學關系Fig.6 Temporal evolutions of the levels of[pp53]and[FSp53]at different[p300]

4 結 語

在本文中，基于Hill動力學與Michaelis-Menten方程，建立理論模型研究GYS2與p53抑制HBV相關的肝癌進展.理論模型考慮：HBx、HDAC1與p53AC結合形成復合體，并抑制GYS2表達；GYS2通過增強調控p53蛋白，進而抑制HCC的發生發展.研究發現，GYS2靈敏地促使了穩態p53(Sp53)的表達上調，并激活下游FSp53的活性，抑制HCC的發生發展.由此表明，在HCV誘發HCC進程中，由于GYS2的缺失，在很大程度上會促進HCC細胞的增殖.通過考察MDM2的濃度隨時間改變的動力學關系，我們發現，MDM2只是輕微改變Sp53幅值水平，GYS2使得Sp53處于穩態.穩態的Sp53經過p300乙酰化后與HBx、HDAC1結合形成復合體，并抑制GYS2表達.由此表明了GYS2在p53介導的糖原代謝中對HCC的抑制作用[18，19].實驗研究數據表明[19]，HBsAg陽性HCC患者的GYS2會被進一步降低，通過考察不同濃度HBx條件下GYS2與Fsp53的動力學特性，我們發現，較高濃度的HBx減弱了GYS2表達，進而弱化了下游FSp53的表達，促進了HCC的發生發展.這也表明了在糖原代謝過程中，HBx與HDAC1、p53AC形成復合體，調控GYS2表達降低，進而使得FSp53表達下調，HCC細胞增殖加快.另外，p300與Sp53結合，也在一程度上調低了FSp53的表達水平，減弱了FSp53對HCC的抑制程度，進而誘導HCC發生發展.

本文中只考慮GYS2與p53協同抑制HBV相關的肝癌進展，事實上，GYS2還可以由糖原合酶激酶3β(GSK3β)磷酸化和抑制，還會被6-磷酸葡萄糖(G6P)變構激活[20，21]，并在肝糖原晝夜節律的合成過程中由CLOCK基因轉錄調控[22]，因此，GYS2的臨床意義及其在人類癌癥糖原調節中的生物功能仍需要進一步研究[35].本文考慮HBx、HDAC1與p53AC抑制GYS2表達，以及GYS2通過增強調控穩態p53表達，進而抑制HCC的發生發展，理論結果符合實驗[19]，表明了GYS2通過與p53協同作用，抑制HBV相關的肝癌基因的表達通路的動力學特性.理論結果進一步深刻揭示了GYS2與p53調控HCC的抑癌機理，可為設計阻斷HBV向HCC轉變的通路治療方案提供理論依據.

表1 模型中的參數取值Table 1 Standard parameter values of the model