溫帶臭蟲細胞色素P450 CYP4C1蛋白生物信息學分析

雷廷 李敏 李榮榮 程璟俠

摘 要：為闡明CYP4家族基因在溫帶臭蟲（Cimex lectularius）解毒代謝機制中的作用，應用生物信息學軟件對溫帶臭蟲CYP4C1蛋白的結構與生物學特性進行預測和分析。通過GenBank數據庫獲得溫帶臭蟲CYP4C1基因與CYP4C1蛋白序列信息，利用生物信息學軟件對CYP4C1基因、CYP4C1蛋白進行分析;并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，溫帶臭蟲CYP4C1的cDNA編碼區(qū)全長為1053bp，編碼500個氨基酸;第5～23位氨基酸為疏水區(qū);不穩(wěn)定指數為37.85;在5～27位氨基酸之間形成1個典型的跨膜區(qū);無信號肽結構;亞細胞定位在細胞質中;具19個磷酸化位點，3個糖基化位點以及4個N-酰基化位點;二級結構預測顯示，主要結構元件為α-螺旋和無規(guī)卷曲;含3個二硫鍵;含P450結構功能域。

關鍵詞：溫帶臭蟲;CYP4C1蛋白;結構;功能;生物信息學

中圖分類號 R384文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）07-0018-06

Bioinformatics Analysis of CYP4C1 Protein in Cytochrome P450 of Cimex lectularius

LEI Ting1 et al.

（1Department of Biology， Taiyuan Normal University， Jinzhong 030031， China）

Abstract： To illuminate the foundation for elucidating the role of CYP4 family genes in the detoxification and metabolism of Cimex lectularius， bioinformatic softwares were applied to predict and analyze the structure and biological characteristics of the CYP4C1 protein. The sequence information was obtained from GenBank database. CYP4C1 and CYP4C1 protein were analyzed by bioinformatics software. And the phylogenetic tree was conducted. The results showed that the full-length of CYP4C1 cDNA is 1053 bp long， encoding 500 amino acids; the predicted hydrophobic region is 5-23 and the instability index is 37.85; the transmembrane region is 5 to 27; it has no signal peptides and the subcellular localization analysis indicates it exists in cytoplasm; .it contains 19 phosphorylation site， 3 glycosylation sites and 4 N-acylation sites; its secondary structure is composed mainly of α-helix and random coil; protein domain prediction shows that it contains the P450s structural domain.

Key words： Cimex lectularius; CYP4C1 protein; Structure; Function; Bioinformatics

溫帶臭蟲（Cimex lectularius）是隸屬于半翅目（Hemiptera）臭蟲科（Cimicidae）臭蟲屬（Cimex）的一類無翅昆蟲，與人類密切相關，主要靠吸食人血為生，晝伏夜出，叮咬人體的皮膚后，可以致使部分皮膚受到損傷，出現紅腫、瘙癢等癥狀，部分人可能發(fā)生激烈的過敏反應，嚴重者會出現丘疹樣蕁麻疹[1]。溫帶臭蟲在全世界范圍內均有分布，近十幾年來，溫帶臭蟲在歐洲、北美、澳大利亞和亞洲等部分發(fā)達國家和地區(qū)重新出現[2-4]。我國部分地區(qū)，溫帶臭蟲也日趨常見，有廣泛發(fā)生的風險[5]。現階段，臭蟲防治的主要方法是噴灑化學殺蟲劑，然而隨著殺蟲劑的大量應用，大多數臭蟲對不同的殺蟲劑有了明顯的抗性[6-7]，使得臭蟲的防治進入新階段。

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系由多個基因家族組成，廣泛分布于動物、植物和微生物等生物體不同的細胞和組織中，是一類末端加氧酶，參與生物體內源性有害物質以及殺蟲劑等外源性有害物質的代謝，在昆蟲中主要與內質網和線粒體相結合發(fā)揮作用。近年來，細胞色素P450的結構和功能研究取得很大的進展，尤其是其在藥物代謝中發(fā)揮的作用。在昆蟲抗性種群中，P450基因顯著過量表達，提示其發(fā)揮的代謝解毒作用是昆蟲產生抗藥性的重要機制之一，一般認為CYP6家族成員與昆蟲抗殺蟲劑的能力關系最為密切[8-10]。但近年來報道，在具抗藥性的昆蟲體內，CYP4家族的基因過量表達，表明CYP4家族在昆蟲的解毒代謝中也發(fā)揮重要作用[11-12]。

本研究通過生物信息學軟件分析方法對溫帶臭蟲基因組CYP4C1及CYP4C1蛋白的結構和生物學特性進行預測分析，旨在為進一步從分子水平研究溫帶臭蟲細胞色素P450基因功能奠定基礎，以期為溫帶臭蟲的綜合防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源 溫帶臭蟲CYP4C1基因序列及其編碼的蛋白質序列來自美國國立生物技術信息中心（NCBI）GenBank數據庫。基因序列CYP4C1登錄號為XM_014386381.2，蛋白序列CYP4C1登錄號為XP_014241867.1。將蛋白序列在NCBI中做Protein BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對，選取Swiss-port數據庫進行比對，算法采用blastp（protein-protein BLAST），以確定CYP4C1蛋白序列的正確性。

1.2 CYP4C1基因序列分析 利用NCBI網站的在線預測工具ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）對基因的開放閱讀框進行分析;使用BioEdit v7.2.5對核酸序列組分進行分析;使用CodonW1-4-2軟件分析密碼子使用率。

1.3 CYP4C1蛋白質序列分析 分別使用ExPASy的ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進行蛋白質序列的理化性質、親疏水性分析;采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白質序列的跨膜區(qū)進行預測;使用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白質的信號肽;利用TargetP 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對蛋白亞細胞定位進行預測;使用ExPASy中的ScanProsite（https：//prosite.expasy.org/）對蛋白質翻譯后修飾位點進行預測;用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預測工具預測其編碼蛋白的二級結構;使用Scratch Protein Predictor（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）中的DIpro預測二硫鍵的位置;運用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質的結構功能域;利用SWISS-MODEL（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）對蛋白質進行同源建模，預測出蛋白質的三級結構。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 選取相似率大于45%的半翅目昆蟲CYP4C蛋白序列，以黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）CYP4C3蛋白序列為外群，使用MEGA X軟件采用鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，替換模型為p-distance，位點進化速率為Gamma distributed，1000次重復計算bootstrap（BP）值（表1）。

2 結果與分析

2.1 CYP4C1基因序列分析 從GenBank數據庫中獲得溫帶臭蟲CYP4C1基因的cDNA序列，登錄號為XM_014386381.2，長度為1712bp。經ORF Finder在線工具分析，最長的開放閱讀框為1503bp，編碼500個氨基酸（圖1）。編碼區(qū)核酸序列組分分析結果顯示分子質量是455.6kDa（單鏈狀態(tài)）909.9kDa（雙鏈狀態(tài)），GC含量為35.06%，AT含量為64.94%。

2.2 CYP4C1基因密碼子使用相對概率 密碼子使用相對概率（RSCU）值反映密碼子在所編碼的氨基酸的同義密碼子中出現的頻率。結果顯示CYP4C1共含有501個密碼子，4種密碼子使用最普遍，依次為AAA-Lys、GAA-Glu、AUU-Ile和UUU-Phe，其中3種均由A或T組成。3種最主要的氨基酸分別為Leu（61）、Ile（45）和Lys（40）。

2.3 CYP4C1蛋白基本理化性質 根據CYP4C1蛋白在BLAST中比對結果，顯示其確定為CYP4C1蛋白。ProtParam軟件分析表明，CYP4C1編碼的蛋白的分子式為C2656H4152N668O735S20，理論相對分子質量為57.8kDa，理論等電點為8.43，不穩(wěn)定指數為37.85，根據Guruprasad方法表明CYP4C1蛋白為穩(wěn)定蛋白[13]。脂肪指數為98.84。在組成該蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，為12.2%，色氨酸（Trp）含量最低，為0.8%。CYP4C1蛋白含有56個帶負電荷的氨基酸殘基，60個帶正電荷的殘基。

2.4 親疏水性 ProtScale在線分析蛋白質的親疏水性（圖2），在N端5-23位氨基酸之間為疏水性區(qū)域，且在第12位氨基酸疏水性達到最強，疏水指數為3.789，最低值-2.644出現在253位，平均疏水指數為-0.120，為親水性蛋白。

2.5 跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位 使用TMHMM Server v.2.0軟件預測CYP4C1蛋白第5～27個氨基酸為跨膜區(qū)域（圖3），表明該蛋白為跨膜蛋白。使用SignalP 5.0 Server進行信號肽預測，顯示該蛋白質無信號肽（圖4）。運用TargetP 2.0 Server進行的亞細胞定位預測表明，CYP4C1蛋白定位在細胞質。

2.6 翻譯后修飾位點 使用ScanProsite對翻譯后修飾位點結果預測顯示，CYP4C1蛋白存在11個蛋白激酶C磷酸位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，3個N-糖基化位點以及4個N-酰基化位點（表3）。

2.7 蛋白質二級結構 利用SOPMA在線預測溫帶臭蟲CYP4C1蛋白的二級結構，結果表明：α–螺旋占比最大，占比為49%，無規(guī)卷曲占比為35.8%，β–轉角占比為3.4%，延伸鏈占比為11.8%（圖5）。使用DIpro預測蛋白質二硫鍵的數量及形成位置（表4）。

2.8 結構功能域 使用SMART進行結構功能域分析顯示CYP4C1蛋白34～495位之間含高度保守的P450結構功能域，包括5個保守結構域，分別為WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG。溫帶臭蟲CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1個氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6個、第8個和第9個氨基酸分別被蘇氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替（圖1）。

2.9 蛋白質三級結構 通過SWISS-MODEL同源建模預測CYP4C1蛋白的三級結構（圖6），模板序列與預測序列的模型相似度為32.25%，對模型進行評估的GMQE為0.66，表明預測所得的三級結構是可靠的。

2.10 系統(tǒng)發(fā)育分析 選擇溫帶臭蟲和其它16種半翅目昆蟲的CYP4C同源序列，以黑腹果蠅作為外群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），結果顯示溫帶臭蟲Cl CYP4C1與紅獵蝽屬物種Rhodnius neglectus Rn CYP4C3關系較近，bootstrap值為85%。其余端部分支bootstrap值均為100%。

3 結論與討論

細胞色素P450是一個可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白超家族，廣泛表達于產生抗藥性的昆蟲品系中，證實是昆蟲產生抗藥性的原因之一[14]。昆蟲的CYP蛋白質的分子量大多位于55～65kD之間[15-16，17]，本研究中，溫帶臭蟲CYP4C1基因編碼區(qū)包含1503bp，編碼500個氨基酸，分子量為57.8kD，位于上述范圍內。軟件ProtParam tool、TMHMM Server v.2.0和SOPMA預測溫帶臭蟲CYP4C1蛋白第5～23/5～27位氨基酸為疏水/跨膜區(qū)，且主要由α-螺旋組成，這與蛋白質的跨膜區(qū)一般是由疏水性氨基酸組成的α-螺旋一致[18]，推測CYP4C1蛋白在與磷脂層錨定結合上起到重要的作用。細胞色素P450主要定位于內質網和線粒體膜上，亞細胞定位顯示該蛋白位于細胞質中，細胞質包括細胞質基質、細胞器和內含物，但該蛋白定位仍需進一步研究。

二硫鍵（S-S）是蛋白質結構中比較穩(wěn)定的共價鍵，起著穩(wěn)定肽鏈空間結構的作用，本研究預測溫帶臭蟲CYP4C1蛋白含3個二硫鍵，表明該蛋白質分子對抗外界壓力的穩(wěn)定性較高。在生物體內有功能的蛋白質通常在翻譯結束后要經過多次位點修飾。有研究表明，蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程在細胞信號轉導中起重要作用，如基因的表達、糖代謝、細胞生存周期等生命活動[19-20]。本研究中，ScanProsite分析溫帶臭蟲CYP4C1蛋白翻譯后修飾位點，該蛋白含有11個蛋白激酶C磷酸位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點，說明其可能受到蛋白磷酸激酶的調控。

CYP4C1蛋白含有P450家族共有的保守結構域：WxxxR，A/GGxE/DTT/S，ExxR，PxxFxPE/DRF和FxxGxxxCxG[21]，與SMART預測的34～495位之間含高度保守的P450結構功能域一致，但溫帶臭蟲CYP4C1蛋白中，A/GGxE/DTT/S的第1個氨基酸被谷氨酸（E）所代替;PxxFxPE/DRF的第6個、第8個和第9個氨基酸分別被蘇氨酸（T）、谷氨酸（E）和丙氨酸（A）所代替，這可能與不同物種有關。

溫帶臭蟲CYP4C1與紅獵蝽屬物種Rhodnius neglectus CYP4C3的一致率和相似率最高，分別為48.7%和67.3%，在基于鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，兩者也聚為一支，且bootstrap值為85%，這或許與兩者都具吸血習性有關。

本研究基于多種生物信息學軟件，全面分析了溫帶臭蟲CYP4C1蛋白序列特征，預測了蛋白功能，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，為溫帶臭蟲的殺蟲劑抗性分子機制研究提供了一定的理論依據。

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（責編：王慧晴）