小麥條銹菌侵染過程中小麥質外體中糖的定量分析

劉秀峰 ，楊兆順 ，樓辰軍 ，許高平 ，邵鳳武

（1.天津市農業科學院農作物研究所，天津300381；2.天津市農作物遺傳育種重點實驗室，天津300381）

由條形柄銹菌小麥專化型（Puccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）引起的小麥條銹病是一種重要的病害，其會造成小麥產量損失巨大[1-2]，在我國曾發生多次大流行，嚴重危害小麥生產安全[3-5]。Pst需要從寄主小麥獲取包括糖類在內的多種營養物質用于菌體生長發育，目前對Pst吸收小麥糖類的機理并不清楚。現在已經明確，包括Pst在內的活體營養專性寄生真菌在侵染寄主過程中由菌絲高度特化形成吸器，同位素標記飼喂以及轉錄表達數據均表明吸器具有吸收寄主營養物質的功能[6-8]。顯微結果表明，Pst吸器穿透小麥細胞壁后并未真正破壞小麥細胞質膜，而是被小麥細胞質膜形成的鞘所包裹，其吸器頸處會產生一個頸環連同吸器外基質形成一個特殊封閉的質外體[9]。已有研究結果表明，質外體是植物病原菌與寄主競爭糖類的重要場所，病原菌侵入寄主質外體干擾寄主糖信號傳導，調控被侵染組織成為強力的庫器官，促使寄主植物源器官產生的糖類物質流向菌體侵入的組織，造成有利于病原菌侵染繁殖的環境[10-14]。目前，小麥質外體中糖濃度的變化與Pst致病性的關系尚未報道。

本研究根據Pst吸器的頸環封閉形成獨立的特殊質外體的特點，分別提取貴農22 和雜46 葉片質外體溶液，定量分析Pst接種后 0、1、2、3、4、8、14 d小麥質外體中葡萄糖濃度，旨在明確小麥質外體中糖濃度的變化與Pst致病性的關系，為探究Pst獲取小麥糖類的關鍵基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥條銹菌（Puccinia striiformisf.sp.tritici）為CYR32，小麥條銹菌繁殖品種為銘賢169。供試小麥分別為雜46（感）和貴農22（抗）。

1.2 試驗主要試劑與儀器

主要試劑為葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶（G6PDH）、D- 己糖-6- 磷酸轉移酶（HKX）、葡萄糖標準品、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、二硫蘇糖醇（DTT）、還原型 β- 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（β-NADH 二鈉）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、牛血清白蛋白（BSA）、草酰乙酸、山梨糖醇等，均購自Sigma 公司。酶標儀及Softmaxpro軟件購自美谷分子儀器有限公司（MolecularDevices）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥條銹菌接種及小麥葉片質外體溶液提取 22 ℃（光/暗為16 h/8 h）恒溫培養至雜46 和貴農22 第7 葉完全展開，用微型噴霧器分別噴霧接種小麥條銹菌CYR32 孢子懸浮液（0.125 mg/mL），分別組成親和組合和非親和組合。以蒸餾水噴霧雜46 和貴農22 為對照。10 ℃下黑暗保濕24 h，然后蓋上隔離罩放置于人工氣候室內，22 ℃下（光/暗為 16 h/8 h）培養。取接種后 0、1、2、3、4、8、14 d 完整的小麥葉片，用75%酒精輕輕擦拭各處理小麥葉片表面，參照PERIYANNAN 等[15]的方法室溫下提取質外體溶液；收集質外體溶液后取5 μL 進行糖的定量分析，2 μL 檢測細胞質污染，其余部分放于-20 ℃保存。

1.3.2 小麥質外體中葡萄糖濃度分析 酶標板每孔加入 5 μL 小麥質外體溶液和 185 μL 新鮮配置的 HEPES 緩沖液（100 mmol/L HEPES，pH 值 7.5，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.02%（m/V）BSA，8 mmol/L NAD+，4 mmol/L ATP）混合均勻后340 nm下測量吸光值，記錄穩定吸光值A0。葡萄糖含量分析參照 SCHOLES 等[16]和 PERIYANNAN 等[15]的方法進行。

1.3.3 葡萄糖標準工作曲線制作 葡萄糖在HKX催化下與ATP 發生磷酸化反應，生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和二磷酸腺苷二鈉（ADP），其中，G-6-P在G6PDH 催化下脫氫生成6- 磷酸葡萄糖酸內酯，并使NAD+還原成NADH。該反應中葡萄糖的消耗與NADH 的生成呈等摩爾關系，NADH 在340 nm處有特征吸收峰。將葡萄糖標準品進行反應一定時間，終止時NADH 的摩爾數等于葡萄糖標準品的摩爾數，測定其吸光值即可求得實際摩爾吸光系數。

精確稱取葡萄糖標準品并配置成終濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mmol/L 的溶液，分別取5 μL 按照1.2.2 方法測量吸光值，繪制圖形，計算線性回歸方程。

1.3.4 質外體溶液的細胞質污染檢測 提取小麥葉片質外體溶液時可能發生細胞質膜受損，導致細胞質污染提取液。為評估細胞質污染的影響，本研究根據細胞質內的蘋果酸在蘋果酸脫氫酶作用下生成草酰乙酸，NADH 氧化脫氫導致340 nm 下吸光值下降，對細胞質污染率進行了檢測。質外體溶液中細胞質污染檢測采用蘋果酸脫氫酶測定方法進行。分別取100 mg 未接種或接種Pst的小麥葉片，加入1 mL 0.2 mol/L 山梨糖醇研磨，作為100%細胞質污染對照。酶標板每孔加入2 μL 研磨所得濾液或小麥質外體溶液和196 μL 蘋果酸脫氫酶緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mmol/L β-NADH 二鈉），340 nm 下測定吸光值，記錄穩定吸光值為A1CK或A1樣品。然后每孔加入 2 μL 草酰乙酸，記錄穩定的吸光值為A2CK或A2樣品。

1.4 數據分析

數據采用Microsoft Excel 統計插件PHStat v 4.1處理；采用Duncan 氏新復極差法測驗法進行數據差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準品工作曲線

葡萄糖標準品 3 次重復配置的 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mmol/L 溶液的吸光值平均值分別為 0.007 8、0.011 7、0.014 1、0.037 3、0.077 4、0.103 8，各濃度吸光度最小值和最大值分別為0.003 7 和 0.014 9、0.008 9 和 0.016 4、0.010 3 和0.019 3、0.031 5 和 0.043 5、0.070 1 和 0.082 8、0.087 4和0.122 0。吸光度—葡萄糖濃度呈線性部分的擬合方程為y＝8.892 0x＋0.018 1（R2＝0.965 6）（圖 1）。

2.2 受Pst 侵染的小麥質外體中葡萄糖的濃度變化

雜46 和貴農22 在蒸餾水噴霧、接種CYR32后 0、1、2、3、4、8、14 d 提取的質外體溶液中細胞質污染率最大為0.293 7，最小為0.125 9；總體上，對照貴農22 和雜46 蒸餾水噴霧后0～3 d 的細胞質污染率差異顯著（P＜0.05），接種后3～14 d 各處理的細胞質污染率差異不顯著（表1），各處理間的細胞質污染率未呈現規律性變化。

表1 接種CYR32 后提取的質外體溶液中細胞質污染率

由圖2 可知，對照蒸餾水噴霧處理后0、1、2、3、4、8、14 d 貴農 22 和雜 46 質外體中葡萄糖濃度波動幅度較小，均未出現明顯的濃度峰值，平均值分別為0.047 3、0.053 0 mmol/L；葡萄糖最高濃度分別為 0.056 3、0.066 6 mmol/L，最低濃度分別為0.035 9、0.036 2 mmol/L。貴農22- 蒸餾水與雜46-蒸餾水的質外體中葡萄糖濃度差異不顯著。

雜 46 接種 CYR32 后 0、1、2、3、4、8、14 d 質外體中葡萄糖濃度呈現明顯的波動，接種后0～3 d濃度急劇升高，接種后3 d 葡萄糖濃度達最高值（1.006 9 mmol/L），是接種后 0 d 濃度（0.047 4 mmol/L）的21.23 倍；接種后4 d 濃度約為最高值的1/3（0.325 8 mmol/L），隨后小幅升高；接種后14 d 濃度（0.412 8 mmol/L）約為最高值的0.41 倍。貴農22 接種 CYR32 后 0、1、2、3、4、8、14 d 葉片質外體中葡萄糖濃度平均值為0.223 0 mmol/L，接種后2 d 葡萄糖濃度從0.077 1 mmol/L（接種后0 d）上升到最高值0.412 2 mmol/L（接種后 2 d），為雜 46 接種 CYR32濃度峰值的0.41 倍；接種后3 d 濃度略有下降（0.386 7 mmol/L），隨后濃度下降為該組合濃度峰值的0.38 倍，并保持相對穩定至接種后14 d（圖2）。CYR32 接種的組合均與對照蒸餾水處理的組合質外體中葡萄糖濃度差異顯著（P＜0.05）；雜46 與貴農22 接種CYR32 后質外體中葡萄糖濃度除接種后0、2 d 外其余時間點差異均顯著（P＜0.05）。

3 結論與討論

目前，對Pst如何從小麥寄主將糖類吸收進入菌體尚不清楚。在大麥柄銹菌Puccinia hordei-大麥、白銹菌Albugo candida-擬南芥、玉米黑粉菌Ustilago maydis-玉米、黃曲霉菌Aspergillus flavus- 玉米等多種病原菌- 寄主互作中，均檢測到蔗糖酶基因轉錄上調和蔗糖酶表達量明顯增加[17-19]。最近研究發現，Pst中編碼蔗糖酶的PsINV基因在Pst- 小麥親和與非親和互作中均大量表達，該基因產物可以高效分解蔗糖[20]。蔗糖酶主要功能是將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，Pst侵染過程中蔗糖酶基因表達量增加可能有利于Pst將小麥質外體中的蔗糖分解成葡萄糖和果糖。Pst基因組中已發現編碼葡萄糖轉運蛋白的基因[21]，但未發現預測編碼果糖轉運蛋白的基因，因此，Pst分解蔗糖產生的果糖累積可能將激發小麥的抗性反應。筆者發現，Pst侵染過程中預測編碼磷酸葡萄糖變位酶、甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉移酶等與糖代謝相關的基因被誘導高度表達并且在不同毒力菌株間表達差異顯著，甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉移酶具有專化的轉運甘露糖功能。如果果糖在變位酶、甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉移酶等催化下轉化為甘露糖，甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉移酶轉運甘露糖，進而在甘露醇脫氫酶作用下還原為甘露醇，既避免了由于果糖與蔗糖的比例升高介導的小麥抗性，又可以將產生的甘露醇作為病原菌的碳源儲備和淬滅寄主的活性氧。Pst如何調節小麥質外體中糖濃度和比例使之有利于菌體生長發育還需要進一步研究。

質外體是植物細胞間營養交流的基礎空間，也是成功侵染的病原菌獲取寄主糖類的重要場所。目前研究表明，受病原菌侵染的寄主植物質外體中的糖變化與其抗性表型相關，例如葡萄受到白粉菌Plasmopora viticola和霜霉菌Erysiphe cichoracearum侵染時質外體中糖含量降低限制了病原菌擴散[22]。受玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis侵染的玉米葉片中糖減少激發了水楊酸介導的對Ustilago maydis的抗性[23]。與此相似，本研究顯示，感病和抗病小麥接種Pst后質外體中葡萄糖濃度均發生動態變化，但抗病小麥比感病小麥的質外體中葡萄糖濃度低，感病的雜46 接種后4 d 質外體中葡萄糖濃度從0.047 4 mmol/L 急劇升高到1.006 8 mmol/L，接種后14 d 葡萄糖濃度雖然比峰值時下降，但依然高于蒸餾水噴霧的雜46 質外體中葡萄糖濃度。而抗CYR32 的貴農22 接種后葉片質外體中葡萄糖濃度雖然也表現升高，但峰值僅為雜46 接種后峰值的0.41 倍。抗性小麥是否通過降低質外體中葡萄糖濃度限制Pst獲取糖類，還需要結合Pst糖轉運相關基因的表達等進一步研究。