Moracin M的簡便合成及其生物活性

李敏欣, 杜文絨, 高金春, 李 磊, 李艷平, 毛澤偉

(云南中醫藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500)

苯并呋喃也稱為香豆酮、氧茚，作為重要的生物活性基團廣泛存在于天然產物和藥物分子中，在抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化以及對心血管系統的保護作用等方面表現出優異的生理活性[1-6]，因此國內外學者對該類化合物進行了大量的研究[7-10]。從桑科植物中分離鑒定出了一系列Moracin族化合物，其生物活性及合成研究已受到越來越多的關注[11]，尤其以Moracin M作為代表。如Arias等[12]利用微波輔助手段完成了Moracin M的合成；Kinoshita等[13]利用Perkin 縮合等五步反應合成得到Moracin M； Maddali等[14]采用過渡金屬鈀催化偶聯反應完成了Moracins (D, E, M)的合成。盡管對Moracin M的合成報道較多，但存在成本較高、反應條件苛刻或操作復雜等缺點。本文以4-甲氧基水楊醛和3,5-二甲氧基溴化芐為原料，經取代、縮合和水解等3步反應實現了Moracin M的合成(Scheme 1)，并對其抗氧化活性和抗炎活性進行了初步研究。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Schimadzu UV-2450型紫外分光光度計；Bruker AM 400型核磁共振波譜儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；AutoSpec Premier P776 型雙聚焦三扇型磁質譜儀。

所用試劑均為化學純或分析純。

1.2 合成

(1) 化合物3的合成

稱取4-甲氧基水楊醛1.52 g(10 mmol)、 3,5-二甲氧基溴芐2.77 g(12 mmol)、碳酸鉀2.76 g(20 mmol)于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL無水N,N-二甲基甲酰胺，100 ℃反應6 h，冷卻至室溫后加入50 mL乙酸乙酯攪拌。有機層用水(3×20 mL) 洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。將殘余物溶于20 mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，加入叔丁醇鉀2.24 g(20 mmol)，置于160 ℃油浴反應6 h(TLC檢測)。冷卻至室溫，加入50 mL乙酸乙酯，有機相用水(3×20 mL) 洗滌，經無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物經硅膠柱(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=20/1,V/V) 層析純化得淡黃色固體(3) 1.19 g，兩步收率42%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:7.52(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.37(d,J=5.6 Hz, 1H), 7.25(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.02(d,J=2.3 Hz, 2H), 6.88～6.91(dd,J=8.6 Hz, 8.6 Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 3.83(s, 6H), 3.82(s, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:161.4, 158.5, 155.8, 154.6, 132.3, 121.7, 112.7, 103.0, 102.6, 100.9, 96.4, 56.0, 55.8。

(2) Moracin M的合成

稱取化合物3564.6 mg(2 mmol)于25 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無水二氯甲烷，在冰水浴攪拌下滴加三溴化硼4 mL(2.0 mol/L in DCM， 8 mmol)，并升至室溫反應12 h(TLC檢測)。緩慢滴加20 mL冰水，攪拌0.5 h后用正丁醇萃取(3×10 mL)，有機相用水(2×20 mL) 洗滌，無水硫酸鈉干燥、減壓濃縮，殘余物經硅膠柱(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=10/1,V/V) 層析純化得白色固體435 mg，收率90%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.59(s, 1H), 9.44(s, 2H), 7.41(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.09(s, 1H), 6.95(s, 1H), 6.77(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71(s, 2H), 6.23(s, 1H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:159.3, 156.2, 155.7, 154.4, 132.2, 121.6, 121.3, 112.9, 103.1, 102.8, 102.0, 98.0; HR-MSm/z: Calcd for C14H9O4{ [M-H]-} 241.0501, found 241.0504。

1.3 抗氧化活性

采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法測定目標化合物的抗氧化能力。以甲醇為參比，在517 nm處測定2.0 mL DPPH反應液+0.5 mL甲醇混合溶液的吸光度A0；取0.5 mL稀釋為不同濃度梯度的樣品溶液于5 mL離心管中，加入2.0 mL的0.1 mmol/L的DPPH反應液混合均勻將混合反應液暗處放置并不斷震蕩30 min，于517 nm處測定其吸光度AX；配置設定好濃度的樣品溶液后各取200 μL于96孔板中在酶標儀下測定其吸光度AX0。

1.4 抗炎活性

(1) 細胞毒性檢測

將凍存好的RAW 264.7細胞從液氮罐中拿出，迅速解凍，吸入含10 mL DMEM培養基(含10% FBS，1%雙抗)的培養皿中。將培養皿置于37 ℃、 5% CO2培養箱中培養。每天對細胞進行換液或傳代，實驗用細胞代數為2～15代。將細胞從培養箱中取出，每個培養皿中加入5 mL左右PBS，用移液槍輕輕吹打細胞，直至培養皿上的細胞被全部吹打下來。細胞計數后按照所需細胞密度(1×105)進行稀釋，之后按照每孔100 μL加入細胞懸液。振蕩均勻，置37 ℃、 5% CO2培養箱中培養24 h。將96孔板中的細胞懸液吸走，每孔加入100 μL已配制好的不同濃度的樣品溶液。繼續放入培養箱中培養24 h。取出96孔板，避光加入MTT(每孔10 μL)，繼續放入培養箱培養4 h，后棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液。振蕩均勻，490 nm處測定OD值，計算細胞存活率。

(2) NO含量檢測

以脂多糖誘導的RAW 264.7小鼠巨噬細胞為炎癥模型，以MTT檢測細胞活力，用Griess試劑顯色法測定細胞模型中NO的產生。取RAW 264.7細胞吹打均勻，按細胞密度為3×105個/孔將細胞懸液加入24孔板中，接種后置于37 ℃培養箱中培養24 h。炎癥模型組用1 μg/mL的LPS進行誘導，記為LPS組，實驗組則加入測試樣品，未處理的細胞記為空白對照組。取出已培養了24 h的RAW 264.7細胞，棄上清，每孔加入500 μL樣品溶液(每個樣品設置3組)，置于37 ℃培養箱中孵育24 h后，取出24孔板，吸取上清按照NO試劑盒說明書用酶標儀測定在540 nm處的OD值，計算NO含量[15]。

2 結果與討論

2.1 合成

以4-甲氧基水楊醛和3, 5-二甲氧基溴芐為原料，參照文獻[16]的方法制備得到化合物2后，在叔丁醇鉀存在下經縮合、三溴化硼水解，以較高收率完成了Moracin M的合成。在合成化合物3時，收率較低，為此對反應條件進行了優化，考察了不同堿對反應效果的影響，見表1所示。結果表明，以叔丁醇鉀為堿，DMF為溶劑時反應效果最好。

表1 堿對3的影響

2.2 抗氧化活性

以50%清除率時的樣品質量濃度(mg/mL)，即IC50值來衡量化合物清除DPPH自由基的能力，IC50值越小，則表示樣品的抗氧化活性越強。Moracin M對清除DPPH自由基的IC50值為0.0267 μmol/L，而陽性對照藥VC為0.0433 μmol/L。與陽性對照藥物VC比較，Moracin M對DPPH自由基的清除能力約為陽性對照藥VC的1.6倍，具有很好的抗氧化活性。

2.3 抗炎活性

細胞毒性檢測結果：當化合物濃度在1.5625、 3.125、 6.25、 12.5和25 μmol/L時，細胞存活率分別為88.09%、 87.94%、 66.28%、 22.51%和2.75%。由此可知，該化合物存在較低細胞毒性。

采用脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞炎癥模型(LPS-RAW264.7)測試Moracin M的體外抗炎活性，結果見圖 1。從中可以看出，LPS模型組與空白對照組相比，NO含量增高，而給藥組能夠降低NO含量，并呈劑量依賴關系。因此，Moracin M對NO的產生具有一定的抑制作用，其可作為一種潛在的抗炎藥物進行深入研究。

圖1 Moracin M的體外抗炎活性

由4-甲氧基水楊醛和3,5-二甲氧基溴芐出發，經3步反應合成了Moracin M，所采用的合成路線短，反應簡單且收率較高，提高了Moracin M的合成效率。此外，該化合物具有很好的抗氧化活性以及潛在的抗炎活性，可對其進行進一步的深入研究。