lncRNA TMPO-AS1靶向miR-1224-5p調控肝癌細胞的增殖和凋亡

金春英

肝癌被列為全球第四大最常見的惡性腫瘤和第三大癌癥相關死亡原因[1]。盡管肝癌的治療方法取得了長足的進步，包括肝切除、化學療法和放射療法或分子靶向療法，但肝癌患者的預后仍然很差[2]。因此，迫切需要了解肝癌發生的分子機制，以探索新型肝癌預后生物標志物，促進肝癌患者治療策略的發展。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是具有200個以上核苷酸的非蛋白質RNA[3]。越來越多的證據表明，lncRNA在病理過程扮演關鍵角色，包括癌癥的發生和發展[4]。lncRNA TMPO antisense RNA 1(TMPO-AS1)在膀胱癌組織和細胞中高表達，促進膀胱癌細胞的生長、遷移和侵襲[5]。TMPO-AS1有助于肺癌發生，這可能是通過上調TMPO引起的[6]。但lncRNA TMPO-AS1在肝癌進展中的確切功能和潛在分子機制需要進一步探索。微小RNA(microRNA，miRNA)是約22個核苷酸的小型非編碼RNA，在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用。最近研究表明，microRNA-1224-5p(miR-1224-5p)的異常表達與幾種人類癌癥有關，例如miR-1224-5p在骨肉瘤組織和細胞中低表達[7]，可能是前列腺癌的腫瘤抑制因子[8]。Chao等[9]學者報告指出，miR-1224-5p表達的上調可能會減少人肝癌腫瘤內皮細胞的增殖，誘導凋亡，抑制遷移和侵襲并抑制管形成，并可能在肝癌中起潛在的腫瘤抑制作用。至于miR-1224-5p在肝癌中的表達和功能仍然不清楚。本研究針對lncRNA TMPO-AS1、miR-1224-5p在肝癌組織中的表達和對肝癌細胞增殖、凋亡的影響進行探討，并分析它們之間的靶向調控，為肝癌發病機制提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 肝癌細胞株HCCLM3購自美國典型培養物保藏中心，Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)培養基購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2 000購自Thermo Fisher Scientific公司，Prime Script TM RT Master Mix試劑盒、Prime Script TM RT Master Mix試劑盒購自大連TaKaRa公司，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma公司，FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司，RIPA緩沖液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA) 蛋白質分析試劑盒、SDS-PAGE凝膠購自上海Beyotime公司，抗細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、抗p21、抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Abcam公司。

1.2 臨床組織標本 2016年2月至2018年8月從本院的肝癌手術中獲得了35對肝癌組織和相鄰的癌旁組織樣本(距離腫瘤組織>3 cm)。這項研究的所有腫瘤組織均經病理學確診，并獲得患者的同意。切除后將組織在液氮中冷凍，直至用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定。

1.3 細胞培養與轉染 將HCCLM3細胞培養于RPMI-1640培養基中，向其中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素。在37℃，含有5% CO2的培養箱中培養。lncRNA TMPO-AS1過表達質粒(pcDNA-TMPO-AS1)，pcDNA質粒(pcDNA)，針對lncRNA TMPO-AS1的小干擾RNA(si-TMPO-AS1)，小干擾RNA陰性對照(si-NC)，miR-1224-3p模擬物(miR-1224-3p)，模擬物陰性對照(miR-NC)，miR-1224-3p抑制劑(anti-miR-1224-5p)，抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)由蘇州GENEWIZ公司合成。使用Lipofectamine 2000用上述質粒或寡核苷酸轉染HCCLM3細胞(接種于6孔板中，融合度為70%)。將細胞分為pcDNA組(轉染pcDNA)，pcDNA-TMPO-AS1組(轉染pcDNA-TMPO-AS1)，si-NC組(轉染si-NC)，si-TMPO-AS1組(轉染si-TMPO-AS1)，miR-NC組(轉染miR-NC)，miR-1224-3p組(轉染miR-1224-3p)，si-TMPO-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-TMPO-AS1和anti-miR-NC)，si-TMPO-AS1+anti-miR-1224-5p組(共轉染si-TMPO-AS1和anti-miR-1224-5p)。轉染48 h后檢測各項指標。

1.4 qRT-PCR測定肝癌組織和細胞中lncRNA TMPO-AS1和miR-1224-5p表達 使用TRIzol試劑從肝癌組織、癌旁組織和HCCLM3細胞。使用Prime Script TM RT Master Mix進行RNA逆轉錄，以得到的互補DNA(cDNA)為模板，使用SYBR Premix Ex Taq II于Applied Biosystems 7500實時PCR系統進行qPCR。根據2-ΔΔCt方法分析lncRNA TMPO-AS1和miR-1224-5p表達。引物如下：lncRNA TMPO-AS1 5，-AGCCCACACACTACAGGCA-3，(F)和5，-GCACAAAAGCAGTACGACCT-3，(R)。內參β肌動蛋白(β-actin) 5，-CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3，(F)和5，-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3，(R)。miR-1224-5p 5，-TGCGCGTGAGGACTCGGGA-3，(F)和5，-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3，(R)。內參U6 5，-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3，(F)和5，-AAATATGGAACGCTTCACGA-3，(R)。

1.5 雙熒光素酶報告實驗測定肝癌HCCLM3細胞熒光素酶活性 將包含假定miR-1224-5p結合位點的HCCLM3野生型(WT)片段或突變(MUT)序列插入pmirGLO雙熒光素酶載體中，分別命名為WT-HCCLM3或MUT-HCCLM3。使用Lipofectamine 2000，在HCCLM3細胞中共轉染WT-HCCLM3或MUT-HCCLM3和miR-1224-5p模擬物或miR-NC。轉染后48 h收獲細胞。根據制造商的說明，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.6 MTT比色法測定肝癌HCCLM3細胞增殖 用上述質粒或寡核苷酸轉染的HCCLM3細胞分別在96孔板中接種24 h、48 h和72 h，加入20 μl/孔的MTT溶液(5 mg/ml)，并繼續溫育4 h。然后，除去上清液，并將反應得到的甲瓚晶體溶解在200 μl的二甲基亞砜中。晶體在室溫下溶解10 min。通過使用Bio Tek酶標儀測量450 nm的吸光度(OD)來評估細胞增殖。

1.7 流式細胞術測定肝癌HCCLM3細胞凋亡 使用FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒分析細胞凋亡。收集用上述質?；蚬押塑账徂D染的HCCLM3細胞，在室溫下黑暗中用10 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶處理細胞15 min。通過具有Cell Quest軟件的FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 免疫印跡實驗(western blot)測定肝癌HCCLM3中CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達 用上述質粒或寡核苷酸處理的HCCLM3細胞在RIPA緩沖液中裂解。使用BCA 蛋白質分析試劑盒對蛋白裂解物進行定量，然后通過SDS-PAGE進行分離。將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜中，然后用5%脫脂牛奶封閉。將膜與一抗在4℃孵育過夜，與以辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h。一抗包括抗CyclinD1(1∶1 000)、抗p21(1∶1 000)、抗Bcl-2(1∶1 000)、抗Bax(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶2 000)。通過增強的化學發光系統觀察印跡。以GAPDH為對照，分析蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 lncRNA TMPO-AS1和miR-1224-5p在肝癌組織中的表達 與癌旁組織比較，肝癌組織中lncRNA TMPO-AS1的表達有所增加，miR-1224-5p的表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA TMPO-AS1 和miR-1224-5p 在肝癌組織中的表達

2.2 lncRNA TMPO-AS1靶向調控miR-1224-5p的表達 采用StarBase工具(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測lncRNA TMPO-AS1與miR-1224-5p之間的相互作用，發現miR-1224-5p可以作為lncRNA TMPO-AS1的靶基因，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR-NC組比較，含有WT-TMPO-AS1的熒光素酶報告質粒與miR-1224-5p在肝癌HCCLM3細胞中共轉染降低了熒光素酶活性(P<0.05)，而含有MUT-TMPO-AS1的熒光素酶報告質粒與miR-1224-5p共轉染，熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。qRT-PCR數據發現，miR-1224-5p在pcDNA-TMPO-AS1組的表達水平低于pcDNA組，si-TMPO-AS1組的表達水平高于si-NC組(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 lncRNA TMPO-AS1的序列中含有與miR-1224-5p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 lncRNA TMPO-AS1 調控miR-1224-5p 的表達

2.3 敲低lncRNA TMPO-AS1表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的影響 相較于轉染si-NC，肝癌HCCLM3細胞中轉染si-TMPO-AS1后，lncRNA TMPO-AS1的表達被抑制(P<0.05)，細胞24 h、48 h和72 h的OD值明顯降低，凋亡率顯著升高，并且CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白表達水平明顯減少，p21蛋白和Bax蛋白表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 敲低lncRNA TMPO-AS1表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的影響;A 增殖和凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表4 敲低lncRNA TMPO-AS1 表達對肝癌HCCLM3 細胞增殖和凋亡的影響

2.4 抑制miR-1224-5p表達逆轉了敲低lncRNA TMPO-AS1表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的作用 與si-NC組比較，si-TMPO-AS1組肝癌HCCLM3細胞的miR-1224-5p表達被促進，細胞48 h和72 h的OD值明顯減少，凋亡率有所增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，p21蛋白和Bax蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與si-TMPO-AS1+anti-miR-NC組比較，si-TMPO-AS1+anti-miR-1224-5p組肝癌HCCLM3細胞的miR-1224-5p表達被抑制，細胞24 h、48 h和72 h的OD值明顯增加，凋亡率顯著減少，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，p21蛋白和Bax蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 抑制miR-1224-5p表達逆轉了敲低lncRNA TMPO-AS1表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的作用;A 增殖和凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 抑制miR-1224-5p 表達逆轉了敲低lncRNA TMPO-AS1 表達對肝癌HCCLM3 細胞增殖和凋亡的作用

2.5 miR-1224-5p過表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的影響 肝癌HCCLM3細胞轉染miR-1224-3p后，同轉染miR-NC組比較，miR-1224-3p組大幅增加miR-1224-3p的表達水平(P<0.05)，明顯減少細胞24 h、48 h和72 h的OD值，顯著增加細胞的凋亡率，以及明顯降低CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白表達水平，顯著升高p21蛋白和Bax蛋白表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 miR-1224-5p過表達對肝癌HCCLM3細胞增殖和凋亡的影響;A 增殖和凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 miR-1224-5p 過表達對肝癌HCCLM3 細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

越來越多的證據表明，包括lncRNA和miRNA在內的非編碼RNA是肝癌發展中的重要調節劑，具有潛在的診斷和治療價值[10]。本研究旨在探討lncRNA TMPO-AS1在肝癌細胞中的作用和機制。結果顯示，在肝癌組織中，lncRNA TMPO-AS1被上調，而miR-1224-5p被下調。敲低lncRNA TMPO-AS1表達或miR-1224-5p過表達可以抑制肝癌進程。值得注意的是，miR-1224-5p是lncRNA TMPO-AS1的靶標。

近年來，lncRNA被公認為包括肝癌在內的重要癌癥生物標志物。因此，鑒定肝癌預后的lncRNA至關重要。根據報道lncRNA TMPO-AS1是一種與癌癥相關的lncRNA，在多種癌癥中充當癌基因，例如，lncRNA TMPO-AS1在胃癌組織中表達上調，上調其表達可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。非小細胞肺癌組織和細胞中的lncRNA TMPO-AS1過表達，TMPO-AS1的下調在體外顯著抑制細胞增殖，集落形成，遷移和侵襲以及體內腫瘤生長[6]。TMPO-AS1可能是前列腺癌的有用診斷和預后標志物，TMPO-AS1過表達通過促進細胞周期進程和促進遷移而增加了前列腺癌細胞增殖，但降低了細胞的凋亡[12]。lncRNA TMPO-AS1在宮頸癌細胞中表達上調，上調其表達可促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13]。在當前的研究中，為了解lncRNA TMPO-AS1在肝癌中的作用，通過qRT-PCR分析檢測了肝癌組織及其相應的癌旁組織中lncRNA TMPO-AS1的表達水平。結果觀察到，與癌旁組織相比，肝癌組織中lncRNA TMPO-AS1表達水平顯著增加。為了調查肝癌中lncRNA TMPO-AS1表達的生物學功能，利用小干擾RNA敲低lncRNA TMPO-AS1的表達，結果發現，其敲低抑制了肝癌細胞的增殖和增殖相關蛋白CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進了細胞的凋亡、增殖相關蛋白p21和促凋亡蛋白Bax的表達。表明與前述研究一致，lncRNA TMPO-AS1在肝癌中起著致癌lncRNA的作用。

miR-1224-5pw位于人類3q27.1染色體，可抑制多種癌癥的發展，包括黑色素瘤[14]和結直腸癌[15]。資料顯示，miR-1224-5p在膠質瘤組織中低表達，具有抑制膠質瘤細胞增殖的作用[16]。上調miR-1224-5p的表達可抑制人肝癌血管內皮細胞的增殖能力，促進肝癌血管內皮細胞的凋亡并降低其遷移、侵襲及血管形成能力[17]。目前的研究證明，miR-1224-5p在肝癌組織中顯著下調。miR-1224-5p過表達可降低細胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達，并誘導細胞凋亡、p21和Bax蛋白表達。這些結果表明，miR-1224-5p在肝癌中發揮了抑癌作用，與前述報道[7-9]相符。

作為基因調節劑，lncRNA對生物過程的調控具有多種分子機制，例如RNA-RNA，RNA-蛋白質和RNA-DNA相互作用[18]，其主要機制之一是作為miRNA海綿來調控miRNA的表達[19]。在這項研究中，生物信息學分析表明lncRNA TMPO-AS1和miR-1224-5p互補結合位點。熒光素酶測定法證實miR-1224-5p是lncRNA TMPO-AS1的直接靶標，并且，qRT-PCR檢測到上調lncRNA TMPO-AS1時miR-1224-5p的表達受到抑制，下調lncRNA TMPO-AS1時其表達被促進，證明lncRNA TMPO-AS1可以靶向負調控miR-1224-5p的表達。進一步探索lncRNA TMPO-AS1在肝癌中發揮作用的機制發現，抑制miR-1224-5p表達能逆轉敲低lncRNA TMPO-AS1表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖的作用，并逆轉敲低lncRNA TMPO-AS1表達促進細胞凋亡的作用。證實靶向調控miR-1224-5p是lncRNA TMPO-AS1影響肝癌發生發展的重要途徑之一。

總之，lncRNA TMPO-AS1在肝癌組織中表達上調，發揮腫瘤促進作用。敲低lncRNA TMPO-AS1的表達可以抑制肝癌細胞的增殖，和誘導細胞凋亡。此外，lncRNA TMPO-AS1的作用機制與靶向miR-1224-5p有關，這提示lncRNA TMPO-AS1可能成為肝癌的候選生物標志物。