LINC00599靶向miR-210對直腸癌細胞增殖、凋亡的影響

廖超 張榮枝 李毅忠

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率、病死率在全球癌癥中分別高居第三位、第四位[1]。直腸癌是結直腸癌的主要類型，盡管包括手術切除、化療和放療在內的多種治療手段都取得了進展，但直腸癌的長期生存仍不令人滿意，尤其是局部進展期和遠處轉移患者[2,3]。因此，迫切尋找有效的診斷或治療靶點、開發新的治療方法已迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(long noncoding rna,lncRNAs)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其通過調控細胞生長、分化、轉移、凋亡和多重耐藥等過程在腫瘤發生中具有致癌或抑癌作用[4,5]。LINC00599是一種保守的基因間非編碼RNA，最初被認為是視網膜發育過程中神經元和少突膠質細胞分化的潛在調節因子[6]。近年研究顯示，膠質瘤組織、細胞系中LINC00599表達下調，LINC00599低表達與較差的無病生存和總生存相關，上調LINC00599通過調節上皮-間質轉化轉化對膠質瘤細胞的遷移和侵襲具有顯著的抑制作用[7]。然而，LINC00599在直腸癌中的作用尚不明確。本研究通過分析直腸癌組織中LINC00599表達情況，探討LINC00599對直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，以期為直腸癌診療提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年10月至2018年5月于我院就診并確診為直腸癌患者的31例手術切除癌組織樣本及與其對應的距離腫瘤邊緣>2 cm的正常組織樣本。患者均未進行術前放療、化療。本研究獲得我院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 SW480細胞購于中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養液、青鏈霉素雙抗、胎牛血清為北京索萊寶公司產品；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白試劑盒購于江蘇康為世紀；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、二甲基亞砜、放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液購于上海碧云天公司；pcDNA3.1-LINC00599(LINC00599過表達載體)、pcDNA3.1(空載質粒)、miR-210抑制劑(anti-miR-210)、抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)、miR-210模擬物(miR-210 mimics)、mimics物陰性對照(miR-NC)由構建上海生工公司完成。膜聯蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京科元生物公司；兔源Ki67、半胱氨酸蛋白酶3(pro-caspase-3)和裂解的caspase-3(cl-caspase-3)、磷酸甘油醛脫氫酶(磷酸甘油醛脫氫酶，GAPDH)抗體，二抗山羊抗兔IgG購于上海賽信通生物技術公司。

1.3 RT-qPCR檢測LINC00599和miR-210表達水平 利用TRIzol試劑從直腸癌組織、癌旁組織和SW480中提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒合成cDNA，利用SYBR Green Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis試劑盒分別測定LINC00599(GAPDH)和miR-210(U6)表達水平，2-ΔΔCT法計算二者相對表達量。LINC00599上游5’-CAACACCTTCCTCCGTGACTGTG-3’，下游5’-GCTGGCTCCTTCTTGTCCACATA-3’；GAPDH上游5’-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3’，下游5’-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’；miR-210上游5’-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.4 細胞培養與分組 SW480細胞采用RPMI-1640培養基(添加10%胎牛血清、1%的青鏈霉素雙抗)在37℃、5% CO2、濕潤培養箱中培養。常規傳代、換液。取對數期SW480細胞按照2×104cells/孔密度接種6孔板，細胞融合50%時，按照脂質體轉染試劑說明書進行細胞轉染，將細胞分為pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00599、anti-miR-NC、anti-miR-210、pcDNA3.1-LINC00599+ miR-NC和pcDNA3.1-LINC00599+ miR-210組。轉染48 h時按照1.2步驟檢測轉染效果，隨后進行其他指標檢測。

1.5 MTT法檢測細胞活力 轉染48 h后，收集SW480細胞，采用RPMI-1640培養液制備單細胞懸液。單細胞細胞密度為3×104cells/mL的。取100 μl細胞懸液(3×103個細胞)加入到96孔板，常規培養48 h時，每孔添加質量濃度為5 mg/ml的MTT試劑20 μl，反應4 h后，棄去孔內培養液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min后，酶標儀檢測490 nm處各孔光密度(optical density，OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=[(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%

1.6 集落形成實驗檢測細胞克隆能力 取對數期細胞，制備單細胞懸液。取5 ml細胞懸液(2×102個細胞)接種到直徑為60 mm培養皿中，米字方向輕輕晃動培養皿使細胞均勻分散。常規培養2周，當培養皿中出現肉眼可見克隆時，終止培養，棄去培養液，PBS小心浸洗2次，干燥后進行甲醇固定和結晶紫染色，顯微鏡下計數>50個細胞的克隆數。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染48 h后，收集SW480細胞，采用1×結合緩沖液制備細胞密度為1×105cells/mL的單細胞懸液。取100 μl細胞懸液加入至流式管內，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，避光反應15 min，補加1×結合緩沖液至500 μl，輕輕混勻，立即上機檢測細胞凋亡情況。

1.8 Western blot檢測Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表達 轉染48 h后，收集SW480細胞，用RIPA裂解緩沖液提取細胞蛋白，BCA蛋白試劑盒測定蛋白樣品濃度。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白樣品，并濕法轉移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂牛奶室溫封閉膜2 h后，用稀釋的一抗溶液孵育膜2 h。沖洗后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。增強化學發光法進行顯色，以GAPDH為內參，Quantity One軟件分析相對灰度值。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 合成含有miR-210結合位點的LINC00599野生型序列或突變位點的突變序列，并將野生型/突變型LINC00599序列克隆到pmirGLO雙熒光素酶載體構建成WT/MUT-LINC00599，該步驟由上海生工生物工程公司完成。利用Lipofectamine 2000將報告載體WT-LINC00599或MUT-LINC00599分別與miR-210 mimic或miR-NC共轉染至SW480細胞，轉染48 h時，使用雙熒光素酶報告基因測定系統測定各組SW480細胞的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 LINC00599在直腸癌中的表達 RT-qPCR檢測顯示，直腸癌組織中LINC00599的表達量為(0.23±0.03)，與癌旁組織LINC00599表達量(1.00±0.06)比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 過表達LINC00599對SW480增殖凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00599組SW480細胞LINC00599的表達水平升高，提示已成功上調SW480細胞中LINC00599的表達水平。過表達LINC00599后SW480細胞存活率、克隆形成數、Ki67和pro-caspase3蛋白表達、miR-210表達均降低，細胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 過表達LINC00599對SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表達的影響;A 過表達LINC00599對SW480凋亡影響；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表達

表1 過表達LINC00599 對SW480 增殖凋亡的影響

2.3 LINC00599靶向miR-210 生物信息分析顯示，LINC00599與miR-210之間存在互補的連續結合位點。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-210 mimics和WT-LINC00599共轉染組SW480細胞的熒光素酶活性較miR-NC和WT-LINC00599共轉染組降低(P<0.05)；miR-210 mimics和MUT-LINC00599共轉染組SW480細胞的熒光素酶活性較miR-NC和MUT-LINC00599共轉染組無顯著變化。見表2，圖2。

表2 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制miR-210對SW480增殖凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-210組SW480細胞miR-210的表達顯著降低，提示轉染anti-miR-210后SW480細胞中miR-210表達受到抑制。抑制miR-210表達后SW480細胞存活率、克隆形成數、Ki67和pro-caspase3蛋白表達、miR-210表達均降低，細胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖3,表3。

圖2 LINC00599靶向miR-210

2.5 抑制miR-210能逆轉LINC00599對SW480增殖凋亡的影響 與pcDNA3.1-LINC00599+ miR-NC組比較，pcDNA3.1-LINC00599+miR-210組SW480細胞miR-210表達、細胞存活率、克隆形成數、Ki67和pro-caspase3蛋白表達均升高，細胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表達均降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖3 抑制miR-210對SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表達的影響;A 抑制miR-210對SW480凋亡影響；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表達

表3 抑制miR-210 對SW480 增殖凋亡的影響

圖4 miR-210能逆轉LINC00599對SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表達的影響;A miR-210能逆轉LINC00599對SW480凋亡影響；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表達

表4 miR-210 能逆轉LINC00599 對SW480 增殖凋亡的影響

3 討論

近年來，LINC00599在人類疾病中的作用引起科學家的廣泛關注。研究顯示，LINC00599參與動脈粥樣硬化、糖尿病相關視網膜血管功能障礙[8,9]。LINC00599還可促進髓源性抑制細胞分化，抑制細胞功能，參與免疫反應[10]。此外，LINC00599在人類腫瘤發生中具有重要作用。Morandi等[11]研究發現，與正常口腔黏膜組織比較，口腔鱗狀細胞癌組織和高級別鱗狀上皮病中LINC00599表現為過渡甲基化。Zhang等[12]證實膠質母細胞瘤LINC00599表達下調，上調其表達可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡發揮抑癌基因作用。然而，在前列腺癌中LINC00599表達上調，LINC00599高表達與腫瘤進展和較差的生存率顯著相關，敲除LINC00599可抑制前列腺癌細胞的增殖、集落形成和侵襲能力[13]。本研究顯示直腸癌組織中LINC00599表達顯著降低。進一步功能分析顯示，過表達LINC00599可降低SW480細胞的存活和集落形成能力，抑制Ki67、pro-caspase3表達，促進clv-caspase-3表達，促進細胞凋亡。以上數據表明LINC00599在直腸癌中具有抑癌功能。

研究顯示，lncRNAs調控下游靶miRNA表達是其發揮功能的重要機制[14]。本研究通過生物信息學分析發現miR-210是LINC00599的下游潛在靶基因，并通過熒光素酶報告基因實驗確定LINC00599對miR-210的靶向作用。此外，RT-qPCR顯示過表達LINC00599可降低miR-210的表達水平。既往研究顯示，乳腺癌組織中miR-210表達上調，miR-210高表達可促進三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的惡性生物學行為[15]。惡性黑色素瘤miR-210亦存在高表達，體外抑制miR-210可下調基質金屬蛋白酶表達，進而抑制A375細胞的轉移能力，是潛在的分子靶向治療位點[16]。此外，結直腸癌患者血清miR-210高表達與腫瘤大小、浸潤程度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關，循環miR-210是結直腸癌患者早期診斷的潛在生物標志物[17]。本研究表明抑制miR-210表達后SW480細胞的存活率、集落形成能力、Ki67和pro-caspase3蛋白表達顯著降低，凋亡率、cl-caspase-3蛋白表達增加，與過表達LINC00599的抑癌作用一致。進一步恢復實驗顯示，過表達miR-210可逆轉LINC00599對SW480細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響。提示LINC00599通過靶向下調miR-210在直腸癌中發揮作用。

綜上所述，本研究首次揭示LINC00599在直腸癌組織中表達降低，并證實LINC00599通過靶向抑制miR-185-5p可抑制直腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。因此，LINC00599有望成為未來臨床直腸癌治療的生物學靶點。