干擾miR-130b表達(dá)增強宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性的研究

南文慶 王勤學(xué) 方彩霞

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)影響著女性的生命健康，癌癥統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示2017年在美國估計有61 380例新發(fā)宮頸癌病例，死亡病例約有10 920例[1]。盡管在預(yù)防、篩查、診斷和治療方面取得了較大的進步，但是宮頸癌仍是全球女性最常見的腫瘤相關(guān)死亡原因，預(yù)后較差[2]。化療藥物順鉑是晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但未能使患者獲得完全緩解[3]。晚期宮頸癌患者對化療的耐藥性迅速發(fā)展是患者預(yù)后不良的重要原因之一[4]。最近的研究表明，microRNA(miRNA/miRs)與腫瘤化療治療抵抗相關(guān)[5]。研究報道m(xù)iR-130b是與腫瘤耐藥密切相關(guān)的miRNA，miR-130b過表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的舒尼替尼耐藥相關(guān)[6]，在肺癌中miR-130b促進順鉑的耐藥[7]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)處理宮頸癌細(xì)胞后，miR-130b的表達(dá)升高，并參與保護宮頸癌細(xì)胞免受TNF-α的細(xì)胞毒性作用[8]。另一項研究中發(fā)現(xiàn)miR-130b通過促進DNA修復(fù)促進宮頸癌細(xì)胞增殖[9]。但miR-130b在宮頸癌中的作用未完全明確，其是否在宮頸癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮重要作用未有報道，因此本文對此進行研究，旨在獲得miR-130b作為調(diào)控宮頸癌細(xì)胞化療敏感性潛在分子靶點的重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2017年4月到2019年4月經(jīng)病理確診的宮頸癌患者，共收集經(jīng)手術(shù)切除治療并在術(shù)前未接受過任何形式治療的宮頸癌組織和癌旁組織98對。其中年齡≤55歲56例，>55歲42例；腺癌22例，鱗癌76例；高分化34例，中分化26例，低分化38例；臨床分期FIGO分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期23例，Ⅲ期21例，Ⅳ期28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0 27例，N1 40例，N2 31例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：有37例，無61例。

1.2 試劑與材料 Trizol試劑和RNA提取試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司；AMV One-step RT-PCR試劑盒，上海生工生物工程有限公司；miR-130b引物和U6引物，上海捷瑞生物工程有限公司；高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，北京清大天一生物技術(shù)有限公司；胎牛血清和胰蛋白酶，美國Hyclone公司；HeLa宮頸癌細(xì)胞系，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；miR-130b inhibitor，百奧邁科生物技術(shù)有限公司；MTS試劑，美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液，上海貝博生物科技公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，上海炎熙生物科技有限公司；PVDF膜，美國millipore公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國Thermo公司；cleave-caspase 9、cleave-caspase 3、Bcl-2和Bax抗體，美國cell signaling公司。

1.3 化療與療效 患者術(shù)后進行鉑類為主的一線化療。治療方案為順鉑70 mg/m2(靜脈滴注)，吉西他濱1 g/m2(靜脈滴注)，d1、8，21 d為1個療程，共4～5個療程，并根據(jù) WHO 實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)進行評價療效。CR(完全緩解)：腫瘤完全消失；PR(部分緩解)：腫瘤最大直徑及最大垂直直徑之積縮小一半；SD(疾病穩(wěn)定)：病變兩徑之積縮小不超過一半，增大≤1/4；PD(疾病進展)：病變兩徑之積增大>1/4。腫瘤大小變化持續(xù)>1個月。化療有效率=(CR+PR)患者例數(shù)/患者總例數(shù)×100%。

1.4 qRT-PCR 手術(shù)切除的宮頸癌和癌旁組織經(jīng)Trizol試劑裂解，采用RNA提取試劑盒提取組織總RNA。采用AMV One-step RT-PCR試劑盒配制PCR擴增反應(yīng)體系：10X One Step RT-PCR Buffer 5 μl、上下游引物各2 μl、RNA 1 μg、AMV RT 0.5 μl、RNase inhibitor 0.5 μl、Taq DNA polymerase和無RNA酶的雙蒸水補足50 μl。擴增條件為45℃逆轉(zhuǎn)錄20 min、PCR預(yù)變性94℃ 5 min，(變性94℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環(huán))，終延伸72℃ 10 min。miR-130b引物F：5’-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6引物F：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’。按照2-ΔΔCt公式以U6為內(nèi)參計算miR-130b的相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞系HeLa的培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，放置在含有5%CO2的37℃全濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長至98%左右時，采用胰酶消化按照1∶3的比例進行細(xì)胞傳代。以2×105個HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，分為NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞，培養(yǎng)12 h，采用脂質(zhì)體2000進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，NC組轉(zhuǎn)染對照，miR-130b inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor，培養(yǎng)8 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)。

1.6 MTS實驗檢測細(xì)胞存活率 以2 000個HeLa細(xì)胞接種至96孔板中，分為NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞，每組設(shè)置6個重復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞分別加入不同劑量的順鉑(0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)處理細(xì)胞48 h。每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑，設(shè)置空白對照組，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在490 nm處吸光度(OD值)。細(xì)胞存活率=(miR-130b inhibitor組平均OD值-空白對照組平均OD值/NC組平均OD值-空白對照組平均OD值)×100%。計算細(xì)胞存活率為50%時所對應(yīng)的順鉑作用劑量(IC50)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，經(jīng)IC50值的順鉑濃度處理48 h后，采用無EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，每組設(shè)置3個重復(fù)管。PBS洗3次，要求每管細(xì)胞≥5×105個。棄掉PBS后，按照凋亡染色試劑盒說明書，每管細(xì)胞中依次加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI細(xì)胞重懸混勻。常溫孵育染色10 min，流式細(xì)胞儀上機檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blotting NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，經(jīng)IC50值的順鉑濃度處理48 h后，采用胰酶消化收集各組細(xì)胞。加入RIPA冰上裂解細(xì)胞，移至EP管中，高速4℃離心30 min后，得到的上清液即為細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，并煮沸變性。變性的蛋白上樣凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)、8%脫脂牛奶室溫封閉1 h，cleave-caspase 9、cleave-caspase 3、Bcl-2和Bax一抗(稀釋度均為1∶500)4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行蛋白條帶曝光。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測宮頸癌組織中miR-130b的表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-130b在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別(1.22±0.54)和(0.96±0.52)，與癌旁組織相比，miR-130b在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(t=3.344，P=0.001)。見圖1。

2.2 miR-130b的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-130b的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、組織類型和分化程度無關(guān)(P>0.05)。與臨床分期早期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者相比，miR-130b分別在臨床分期晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者組織中的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.3 miR-130b的表達(dá)與宮頸癌患者化療療效的關(guān)系 miR-130b在宮頸癌組織中的表達(dá)高于其配對的癌旁組織中的表達(dá)為miR-130b高表達(dá)組(59例)，miR-130b在宮頸癌組織中的表達(dá)低于其配對的癌旁組織中的表達(dá)為miR-130b低表達(dá)組(39例)，miR-130b高表達(dá)組患者的化療有效率低于miR-130b低表達(dá)組(P<0.05)。見表2。

圖1 qRT-PCR檢測miR-130b 在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)水平，*P<0.05

表1 miR-130b 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

表2 miR-130b 表達(dá)水平與宮頸癌換化療療效的關(guān)系 例(%)

2.4 miR-130b inhibitor的干擾效果 miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HeLa，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-130b在NC組和miR-130b inhibitor組細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)量分別為(1.00±0.01)和(0.51±0.06)，與NC比較，miR-130b inhibitor組細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)降低(t=13.80,P=0.000)。見圖2。

2.5 miR-130b inhibitor對HeLa細(xì)胞化療敏感性的影響 NC組和miR-130b inhibitor組HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度的順鉑處理，培養(yǎng)48 h后MTS結(jié)果顯示在同一順鉑濃度處理下，miR-130b inhibitor組細(xì)胞的存活率顯

圖2 qRT-PCR檢測miR-130b inhibitor干擾效果,*P<0.05

著低于NC組細(xì)胞的存活率(P<0.05)，NC組Hela細(xì)胞順鉑IC50為(7.98±0.21)μmol/L，miR-130b inhibitor組Hela細(xì)胞順鉑IC50劑量為(6.04±0.15)μmol/L，與NC組比較，miR-130b inhibitor組Hela細(xì)胞的順鉑IC50劑量降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 MTS檢測miR-130b inhibitor對HeLa細(xì)胞化療敏感性的影響,*P<0.05

2.6 miR-130b inhibitor對順鉑處理的HeLa細(xì)胞凋亡率的影響 NC組和miR-130b組inhibitor組HeLa細(xì)胞經(jīng)3 μmol/L的順鉑處理，培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞實驗結(jié)果顯示NC組細(xì)胞凋亡率為(2.30±0.36)%，miR-130b inhibitor組細(xì)胞凋亡率為(24.60±0.98)%，與NC組比較，miR-130b inhibitor組細(xì)胞的凋亡率降低(t=36.831,P=0.000)。見圖4。

2.7 miR-130binhibitor對順鉑處理的HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響 NC組和miR-130b組inhibitor組HeLa細(xì)胞經(jīng)3μmol/L的順鉑處理，培養(yǎng)48 h后western blotting結(jié)果顯示與NC組比較，miR-130b inhibitor組細(xì)胞中ABCG2和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，cleave-caspase-9和cleave-caspase-3蛋白的表達(dá)表達(dá)增加(P<0.015)。見圖5，表3。

圖4 miR-130b inhibitor對順鉑處理的HeLa細(xì)胞凋亡率的影響,*P<0.05

圖5 miR-130b inhibitor對順鉑處理的HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

表3 miR-130b 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

宮頸癌在女性相關(guān)腫瘤中發(fā)病率占第二位，其病死率占第四位，長期人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因，目前宮頸癌的發(fā)病仍處于上升狀態(tài)[10]。宮頸癌的治療主要包括手術(shù)切除治療、化療治療、放射治療和分子靶向等治療，其中大多數(shù)早期宮頸癌患者可以通過手術(shù)和放化療的聯(lián)合治療取得較好的臨床療效，但是對于晚期宮頸癌患者，經(jīng)常會產(chǎn)生化學(xué)耐藥性，不能從化學(xué)治療中受益[2]。由于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，早期宮頸癌患者容易進展為晚期或者復(fù)發(fā)，目前針對晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)化治療是基于順鉑的化學(xué)治療，腫瘤細(xì)胞對順鉑的不敏感性阻礙患者臨床療效[3]。順鉑耐藥性的分子機制很復(fù)雜而且不完善，因此研究調(diào)控宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)鍵分子，對增強宮頸癌細(xì)胞敏感性以改善患者預(yù)后具有重要意義。

miRNA屬于小RNA家族，不具備蛋白質(zhì)編碼作用，但可以通過與靶基因的3’-UTR結(jié)合調(diào)控靶基因的降解和翻譯。大量研究表明，miRNA參與了包括細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞耐藥等各種腫瘤惡性生物學(xué)過程[11]。miRNA的失調(diào)促進腫瘤順鉑化學(xué)耐藥性的作用引起了越來越多的關(guān)注[5]。miR-130b在肝細(xì)胞肝癌、胃癌、前列腺和骨肉瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常，但其在腫瘤中發(fā)揮的作用并不一致[12-15]。miR-130b在肝細(xì)胞肝癌和胃癌中促進腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮促癌基因的作用[12,13]，miR-130b在前列腺和骨肉瘤中低表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用[14,15]。目前miR-130b在宮頸癌中報道為促癌因子，Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-130b在TNF-α處理的宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)增加，并通過靶向抑制PTEN基因保護宮頸癌細(xì)胞免受TNF-α的殺傷作用，促使宮頸癌細(xì)胞存活。在Yang等[9]的另一篇報道中，過表達(dá)miR-130b通過修復(fù)TNF-α引起的腫瘤細(xì)胞DNA損傷而增強細(xì)胞的活力。但miR-130b在宮頸癌組織中的表達(dá)水平未知，本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-130b在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于在其配對的癌旁組織中的表達(dá)，并且統(tǒng)計分析顯示miR-130b的表達(dá)水平與宮頸癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明miR-130b促進宮頸癌的惡性進展，與Yang等[8,9]的研究報道相符。

宮頸癌患者，尤其是宮頸癌晚期對化學(xué)治療反應(yīng)性較低，是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因[4]。miR-130b的高表達(dá)與宮頸癌晚期相關(guān)，研究報道m(xù)iR-130b與多種腫瘤化學(xué)藥物耐藥相關(guān)，miR-130b在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于其在正常腎臟組織中的表達(dá)，并通過負(fù)調(diào)控PTEN促進舒尼替尼的耐藥[6]。肺癌中，miR-130b通過Wnt/β-catenin途徑靶向PTEN介導(dǎo)順鉑化學(xué)耐藥性、細(xì)胞增殖和凋亡[7]。順鉑是治療宮頸癌的一線化學(xué)藥物，本文通過分析宮頸癌患者術(shù)后進行以順鉑為主化學(xué)治療的療效，結(jié)果顯示miR-130b高表達(dá)組患者的化療有效率低于miR-130b低表達(dá)組，表明miR-130b與宮頸癌化療耐藥相關(guān)。采用miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HeLa，在細(xì)胞水平研究miR-130b對宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，MTS檢測結(jié)果顯示干擾miR-130b的表達(dá)促進順鉑對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，干擾miR-130b表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性增加。化學(xué)抗性的分子機制非常復(fù)雜，包括耐藥相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，ABCG2屬于乳腺癌細(xì)胞耐藥ABC超家族，表達(dá)于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體細(xì)胞膜上，是介導(dǎo)腫瘤耐藥的重要蛋白，研究報道ABCG2過表達(dá)在宮頸癌耐藥中發(fā)揮重要作用[16]。化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是抗腫瘤細(xì)胞存活的重要途徑，在受到外界刺激，凋亡信號促使凋亡蛋白caspase-9活化為cleave-caspase-9，并促進下游凋亡蛋白caspase-3的活化，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，促進凋亡的發(fā)生[17]。抗凋亡蛋白Bcl-2過表達(dá)在促進宮頸癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要[18]。本文干擾miR-130b的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)順鉑處理的細(xì)胞凋亡增加，ABCG2和Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，cleave-caspase-9和cleave-caspase-3蛋白的表達(dá)增加，表明干擾miR-130b的表達(dá)可能通過調(diào)控耐藥相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白增強宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性。

綜上所述，miR-130b在宮頸癌組織中高表達(dá)，與宮頸癌的惡性進展相關(guān)，并與患者化療有效率差相關(guān)。干擾miR-130b的表達(dá)促進宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，其分子機制可能是通過調(diào)控耐藥蛋白和凋亡蛋白發(fā)揮作用。miR-130b可能是增加宮頸癌化療敏感性的潛在分子，是治療宮頸癌的候選靶點。