miR-148a靶向S1PR1抑制彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖和遷移機制研究

唐懿 劉彥麟 宋黎

漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)屬于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)發病率最高亞型，占NHL的30%～40%，平均發病年齡在60歲左右，男性高于女性，呈B淋巴細胞彌漫性惡性增殖[1,2]。DLBCL在臨床上、遺傳學、形態學均表現出異質性，目前DLBCL的發病機制還未有統一定論，最新研究表明miRNAs表達水平與其發生發展和預后有關，近年來已經成為研究的熱點內容[3]。人微小RNA(microRNA，miRNA)長度為21～24個核苷酸序列，能夠與靶基因3’UTR配對，降解或抑制靶基因mRNA翻譯，從而調控腫瘤如細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生理過程[4]。miRNAs在腫瘤中表達失調現象也十分常見。有研究表明，miR-148a低表達與腫瘤發生發展相關，上調miR-148a表達水平能夠下調c-myc表達水平，抑制肺癌細胞侵襲轉移[5,6]。1型1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor1，S1PR1)屬于1-磷酸鞘氨醇受體家族的G蛋白偶聯受體，作為機體內重要的信號傳導分子，能夠與其配體1-磷酸鞘氨醇(S1P)結合從而調控下游信號通路活性[7]。研究表明，S1PR1能夠調控BATF3信號通路來抑制霍奇金淋巴瘤(HL)細胞增殖，發現S1PR1作為一種癌基因，能夠上調許多信號通路參與腫瘤的發生發展進程[8,9]。miR-148a和S1PR1均與腫瘤發生發展關系，且在DLBCL中未見相關報道，本研究測定miR-148a mimic轉染后OCI-LY19細胞miR-148a、S1PR1及相關通路蛋白表達水平，分析二者對OCI-LY19細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；DMEM培養液購自北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒(DP420)購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人S1PR1、兔抗人ERK、兔抗人p-ERK、兔抗人STAT3、兔抗人p-STAT3、兔抗人PDGF-A、兔抗人PDGF-B、兔抗人BcL-XL、兔抗人McL-1、兔抗人內參U6、羊兔二抗購自美國Bioworld公司；miR-148a mimic、miR-148a陰性對照序列購自上海生工生物公司；Multiskan FC酶標儀購自美國賽默飛公司；電泳槽和轉膜槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養、轉染 細胞系：人B淋巴HMy2.CIR細胞、彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY19細胞均購自中科院細胞庫。細胞培養：兩種細胞均采用常規培養，培養基中添加1%青鏈霉素雙抗，10%血清，培養條件：5%CO2，相對濕度98%，溫度37℃。隔天換液，待細胞密度在80%～90%時胰酶消化傳代，收集對數生長期細胞用于后續實驗。細胞轉染：將OCI-LY19細胞以1×105個/孔的密度接種到24孔板上，待細胞密度在50%左右時棄去培養液，首先將5 μl Lipofectamine TM2000與100 μl DMEM培養液混合均勻，25℃靜置20 min，用培養液調整miR-148a mimic、miR-148a陰性對照序列濃度為20 μmol/L，25℃靜置20 min，將miR-148a mimic、miR-148a陰性對照、等體積培養基(作為miR-148a空白對照)分別與LipofectamineTM2000混合均勻，25℃靜置20 min，加入到含有OCI-LY19細胞的24孔板中。實驗分組：(1)對照組；(2)miR-148a陰性對照；(3)miR-148a mimic組。

1.3 RT-qPCR檢測OCI-LY19細胞miR-148a表達水平 使用試劑盒提取各組細胞中總RNA，逆轉錄得到cDNA，采用實時熒光定量PCR儀對miR-148a進行擴增，反應體系共20.0 μl，其中SYBR Mix10.0 μl，cDNA(25 ng/ml)2.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl。反應條件：94℃預變性300 s，94℃變性30 s，65℃退火60 s，75℃延伸30 s，30個循環后，75℃終末延伸5 min。設置6個復孔，采用2- CT法對miR-148a表達水平進行定量分析。見表1。

表1 miR-148a 和內參U6 引物序列

1.4 蛋白印跡法(Western blotting，WB)測定OCI-LY19細胞S1PR1、ERK、p-ERK、STAT3、p-STAT3、PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達水平 實驗分組同“1.2”。使用RIPA法提取并測定各組細胞總蛋白含量，蛋白以50 μg/孔加樣，垂直電泳法分離所需目標蛋白，用BIO-RAD法將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉將結合位點封閉1 h。加入兔抗人S1PR1、兔抗人ERK、兔抗人STAT3、兔抗人p-ERK、兔抗人p-STAT3、兔抗人PDGF-A、兔抗人PDGF-B、BcL-XL、McL-1、兔抗人內參β-Actin(稀釋比例均為1∶1 000)，4℃孵育過夜，用PBS清洗后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min，PBS清洗，顯色、曝光。用凝膠成像設備觀察。

1.5 MTT法測定OCI-LY19細胞活性 實驗分組同“1.2”，將細胞接種到96孔板上，每組設置6個復孔，培養箱培養過夜，棄取培養基，PBS清洗3次，加入不含血清的培養基繼續培養。培養48 h后加入25 μl MTT(5 mg/ml)溶液，培養4 h后棄去培養液，加入150 μl DMSO溶液，100 r/min 37℃恒溫震蕩10 min，測定在490 nm處吸光度(optical density，OD值)。根據公式計算OCI-LY19細胞活性。細胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 劃痕實驗測定OCI-LY19細胞體外遷移能力 實驗分組同“1.2”，將OCI-LY19細胞以5×105個/孔接種到6孔板，培養箱中培養，待細胞密度70%～80%時，用滅菌后的200 μl槍頭垂直于孔底，均勻劃出細胞劃痕，PBS清洗細胞碎片，加入無血清培養液，設置6個復孔，培養48 h后用熒光顯微鏡觀察細胞遷移程度，拍照記錄，根據公式計算細胞遷移能力。遷移能力(%)=(初始兩側距離-觀察時兩側距離)/初始兩側距離×100%。

1.7 雙熒光素酶實驗檢測miR-148a與S1PR1的靶標關系

1.7.1 熒光素酶報告實驗突變型載體的制備:用TargetScan分析S1PR1序列發現，在3’UTR區域有兩個miR-148a結合區域。將該區域擴增后與PGEM-T載體相連，篩選目標序列并與pGL4相連，成功構建p-GL4-S1PR1-3’UTR質粒，以此質粒為模板對S1PR1-3’UTR進行定點突變(Del1，Del2)，進一步經測序篩選構建p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1，Del2質粒。

1.7.2 熒光素酶測試報告實驗:將OCI-LY19細胞以1×105個/孔接種到24孔板，培養過夜后，將p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1，Del2質粒與miR-148a mimic、miR-148a陰性對照共染，設置6個復孔，轉染24 h后，加入100 μl熒光素酶檢測試劑，用多功能酶標儀測定吸光度，之后加入Stop&Glo試劑并測定吸光度，熒光素酶的相對活性以前后熒光強度比值表示。

2 結果

2.1 miR-148a mimic轉染后OCI-LY19細胞中miR-148a、S1PR1、p-ERK、p-STAT3表達水平 與HMy2.CIR細胞組比較，OCI-LY19細胞對照組miR-148a表達水平顯著降低(P>0.05)，ERK、STAT3蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，S1PR1蛋白表達水平、ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組、miR-148a陰性對照組比較，miR-148a mimic組miR-148a表達水平顯著升高(P<0.05)，ERK、STAT3蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，S1PR1蛋白表達水平、ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 miR-148a 、S1PR1 、p-ERK 、p-STAT3 表達水平

圖1 S1PR1、p-ERK、p-STAT3表達水平；A HMy2.CIR細胞組；B 對照組；C miR-148a mimic組；D miR-148a陰性對照組

2.2 miR-148a mimic轉染后OCI-LY19細胞活性 與對照組比較，miR-148a mimic組細胞活性顯著降低降低(P<0.05)，miR-148a陰性對照組細胞活性無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 miR-148a mimic 轉染后OCI-LY19 細胞活性

2.3 miR-148a mimic轉染后OCI-LY19細胞遷移能力 與對照組比較，miR-148a mimic組細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，miR-148a陰性對照組細胞遷移能力無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4 miR-148a mimic 轉染后OCI-LY19 細胞遷移能力

2.4 miR-148a mimic轉染后OCI-LY19細胞PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1蛋白表達水平 與對照組比較，miR-148a mimic組PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-148a陰性對照組無明顯變化(P>0.05)。見表5，圖2。

表5 miR-148a mimic 轉染后OCI-LY19 細胞PDGF-A 、PDGF-B 、BcL-XL 、McL-1 表達水平

圖2 PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達水平;A 對照組；B miR-148a陰性對照組；C miR-148a mimic組

2.5 miR-148a與S1PR1靶標關系 Targetscan分析表明，miR-148a序列3’UTR區存在2個S1PR1結合位點。熒光素酶報告實驗顯示，與p-GL4-S1PR1-3’UTR組比較，p-GL4-S1PR1-3’UTR+miR-148a mimic組的熒光素酶相對活性顯著降升高(P<0.05)。與p-GL4-S1PR1-3’UTR+miR-148a mimic組比較，p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1+miR-148a mimic組、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2+miR-148a mimic組和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1,Del2+miR-148a mimic組的熒光素酶相對活性均顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 OCI-LY19 細胞熒光素酶的相對活性

3 討論

DLBCL臨床上表現為強侵襲性和中高度惡性，約60%患者可以通過R-CHOP方案治愈，但仍有部分患者耐藥，出現病情反復，預后不良[10]。

miR-148a在腫瘤組織或細胞中異常表達及調控細胞增殖、侵襲、遷移的作用受到越來越多研究者的關注，研究發現在食管癌組織中miR-148a表達水平下調，過表達miR-148a能夠抑制人食管癌細胞遷移、侵襲[11]。本研究表明，與HMy2.CIR細胞相比，OCI-LY19細胞中miR-148a表達水平顯著降低，提示在DLBCL細胞中miR-148a低表達，可能與DLBCL有關。研究表明，miR-148a過表達可以靶向Wnt/β-catenin信號通路，下調VEGF表達水平，抑制血管生成、細胞增殖[12]。徐桂麗等[13]研究表明miR-148a在NSCLC外周血中低表達，HPIP高表達，過表達miR-148a能夠下調HPIP表達水平，從而抑制A549細胞增殖。本研究發現，與對照組比較，miR-148a mimic組細胞活性、遷移能力顯著降低，而miR-148a陰性對照組無明顯變化，提示上調miR-148a表達水平能夠抑制OCI-LY19細胞增殖、遷移能力，推測miR-148可能通過調控某種信號通路來抑制OCI-LY19細胞增殖、遷移。

近年S1PR1促進腫瘤發生發展的作用引起研究者們的注意，S1PR1和S1PR3在卵巢癌組織中高表達，且與組織微血管密度(MVD)相關，提示S1PR1和S1PR3可能會成為評價卵巢癌預后新指標，并為其治療提供新靶點[14]。本研究發現，與HMy2.CIR細胞相比，OCI-LY19細胞中S1PR1蛋白表達水平顯著升高，提示在DLBCL細胞中S1PR1高表達，可能促進DLBCL發生發展進程。Weichand等[15]研究表明S1PR1能夠調控NLRP3/IL-1β信號通路靶向腫瘤巨噬細胞促進腫瘤淋巴轉移，浸潤小鼠乳腺腫瘤中S1PR1的遺傳缺失可防止肺轉移和腫瘤淋巴管生成。隨后研究表明，上調S1PR1表達水平可調節RhoA活化以加速VE-鈣粘蛋白磷酸化，導致EDV增加和乳腺癌中VM減少，提示S1PR1可為乳腺癌患者的抗血管生成治療提供新的思路[16]。本研究表明，與對照組比較，miR-148a mimic組S1PR1表達水平顯著降低，提示上調miR-148a表達水平可抑制S1PR1表達，可能通過此通路抑制OCI-LY19細胞增殖、遷移。TargetScan數據庫預測顯示miR-148a序列3’UTR區存在2個S1PR1結合位點，雙熒光素酶實驗證實S1PR1是miR-148a作用靶點，說明miR-148a能夠調控S1PR1表達抑制OCI-LY19細胞增殖、遷移，但是具體通過調控哪種信號通路還有待進一步。

S1PR1高表達能夠激活ERK1/2信號通路，從而促進NSCLC細胞增殖和侵襲以及體內腫瘤生長，此外下調S1PR1表達水平能夠抑制STAT3活性并在體外和體內抑制乳腺癌細胞的生長[17]。ERK活化后，可進一步調控c-jun，c-fos，AP-1，NF-κb等轉錄因子的激活，從而參與癌癥的發生發展；STAT3能夠調控大部分癌基因的表達，是重要的癌基因和轉錄因子[18]。PDGF-A、PDGF-B作為p-ERK的下游靶基因，在腫瘤中PDGF-A、PDGF-B高表達，可持續高水平地促進腫瘤細胞增殖、遷移，參與癌癥發生發展。BcL-XL和McL-1是STAT3下游靶基因，能夠抑制細胞凋亡，在大部分腫瘤中高表達。本研究發現，與對照組相比，miR-148a mimic組ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平、PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達水平顯著降低，提示miR-148a高表達，可能通過下調S1PR1表達水平進一步調控ERK/STAT3信號通路下調PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達水平，從而抑制OCI-LY19細胞增殖、遷移。

綜上所述，miR-148a在彌漫大B細胞淋巴瘤細胞中低表達，上調miR-148a表達水平能夠下調S1PR1表達，可能通過ERK/STAT3信號通路來抑制彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖和遷移。但miR-148a在制彌漫大B細胞淋巴瘤的發生發展進程中的表達情況仍需進一步研究。