ACHBLF患者外周血中NK與NKT細胞的變化及與肝功能和細胞因子的關系

程濤 伍偉玲 鐘宋 黃河

慢加急性乙型肝炎肝功能衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)的病情發展迅速、肝功能在短時間內發生惡化，患者的預后較差且死亡率較高[1,2]。目前，ACHBLF的發病機制仍未完全明確，HBV在肝細胞內持續復制雖然會直接引起肝細胞變性、壞死，進而造成慢性乙型肝炎病程中不同程度的肝損傷，但單純依靠HBV復制無法完全解釋慢性乙型肝炎病程向急性肝衰竭的進展。近年來，免疫應答紊亂與ACHBLF發生的關系受到了越來越多的關注，肝臟內免疫細胞的浸潤及活化、多種細胞因子的分泌是ACHBLF發生的重要誘因[3,4]。自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)和自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT細胞)是體內重要的非特異性免疫細胞，已有研究證實，肝衰竭動物模型中肝臟NK細胞及NKT細胞進入增多、殺傷活性增強[5]。在下列研究中，我們具體分析了ACHBLF患者外周血中NK與NKT細胞的變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年6月至2018年8月南部戰區空軍醫院感染科診斷為ACHBLF的45例患者作為ACHBLF組，診斷為慢性乙肝的58例患者作為CHB組。ACHBLF患者符合中華醫學會《肝衰竭診療指南2018版》[6]，CHB均符合《慢性乙型肝炎防治指南2019版》[7]，排除合并其他類型肝炎病毒感染的患者、入組前3個月內接受過抗病毒治療的患者以及診斷為原發性肝癌的患者。另取同期在南部戰區空軍醫院體檢中心體檢的50例健康志愿者作為研究的對照組。ACHBLF組中男26例，女19例；年齡26～48歲；CHB病程9～18年；CHB組中男32例，女26例；年齡24～51歲；CHB病程9～16年；對照組中男28例，女22例；年齡25～50歲。3組受試者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血免疫細胞含量檢測方法:取新鮮的外周血0.1 ml，立即進行免疫細胞檢測，加入熒光標記的CD3、CD56單克隆抗體，4℃避光孵育30 min后加入2 ml 紅細胞裂解液(1∶10稀釋)，室溫避光孵育10 min，離心后取沉淀并加入FACS緩沖液洗滌、離心1次，最后用200 μl FACS緩沖液重懸細胞，在流式細胞儀上測定CD3-CD56+NK細胞及CD3+CD56+NKT細胞的含量。

1.2.2 血清生化指標檢測方法:取外周血后離心，分離血清并在-80℃保存。檢測是，采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)的含量，采用酶聯免疫吸附試劑盒測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-32(IL-32)、CC亞族趨化因子配體20(CCL20)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的含量。

2 結果

2.1 外周血中NK細胞及NKT細胞的含量 ACHBLF組和CHB組患者外周血中NK細胞及NKT細胞的含量均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，ACHBLF組患者外周血中NK細胞及NKT細胞的含量均顯著低于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3 組受試者外周血中NK 細胞及NKT 細胞比較

2.2 血清中肝功能指標的含量 ACHBLF組和CHB組患者血清中ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL的含量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，ACHBLF組血清ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL的含量均顯著高于CHB組(P<0.05)。見表2。

表2 3 組受試者血清中肝功能指標比較

2.3 血清中炎性因子的含量 ACHBLF組和CHB組患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，ACHBLF組患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均顯著高于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 相關性分析 Pearson檢驗分析ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量與血清肝功能指標、炎癥細胞因子含量的相關性，ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量與血清中ALT、AST、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量呈負相關(P<0.05)。見表4。

表3 3 組受試者血清中炎癥細胞因子比較

表4 外周血中NK 細胞、NKT 細胞與血清肝功能指標、炎性因子的相關性

3 討論

NK細胞及NKT細胞是參與固有免疫應答的免疫細胞，已有研究證實，肝衰竭動物模型中肝臟NK細胞及NKT細胞進入增多、殺傷活性增強[5]。本研究證實，ACHBLF組和CHB組患者外周血中NK細胞及NKT細胞的含量均顯著降低且ACHBLF組患者外周血中NK細胞及NKT細胞的含量均顯著低于CHB組，與動物實驗中NK細胞及NKT細胞的變化吻合，說明在CHB向ACHBLF發展的病程中，患者外周血中NK細胞和NKT細胞的含量呈降低趨勢，這可能與NK細胞和NKT細胞在肝臟內浸潤的增多有關。

NK細胞和NKT細胞在肝臟內的浸潤能夠殺傷HBV并抑制HBV復制[10,11]，但是，過度激活和浸潤的NK細胞和NKT細胞具有極強的促炎活性，在殺傷HBV的同時能夠持續造成肝細胞的破壞，最終發展為肝衰竭[12-14]。本研究分析證實，ACHBLF組和CHB組患者血清中各項肝功能指標均顯著升高且ACHBLF組患者血清中各項肝功能指標均顯著高于CHB組。這就說明在CHB向ACHBLF發展的病程中，患者的肝功能不斷惡化。進一步通過相關性分析發現：ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量與血清中肝損傷指標呈負相關。說明ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量的降低以及肝臟中NK細胞、NKT細胞的浸潤與肝功能的惡化有關。

NK細胞和NKT細胞在肝臟內所介導的促炎效應是造成肝損害的重要環節，多種炎性因子在環節中大量分泌[15,16]。本研究的分析發現，ACHBLF組和CHB組患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量均顯著升高且ACHBLF組患者血清中上述細胞因子的含量均顯著高于CHB組。上述細胞因子具有促炎、促進細胞因子趨化等活性[17-21]，結合細胞因子的生物學功能分析，在CHB向ACHBLF發展的病程中，炎性反應的激活程度不斷加劇。進一步通過相關性分析發現：ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量與血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-32、CCL20、HMGB1的含量呈負相關。這就說明ACHBLF組患者外周血中NK細胞、NKT細胞含量的降低以及肝臟中NK細胞、NKT細胞的浸潤能夠直接激活炎性反應、促進多種炎性細胞因子的分泌，進而通過炎癥細胞因子的生物學效應來引起肝細胞損害、造成肝衰竭的發生。

綜上所述，在CHB向ACHBLF發展的過程中，患者外周血中NK與NKT細胞含量的減少且與肝功能惡化、炎性反應激活密切相關，由此也提示ACHBLF肝臟內NK與NKT細胞的大量浸潤和激活能夠造成肝細胞損害以及炎性因子的大量分泌。