突發性耳聾患者血清miR-431、Eya4表達與耳蝸功能的相關性研究

鮑靖

突發性耳聾是臨床上耳鼻喉科較常見急癥，該疾病主要是指患者在72 h內突然發生不明原因的感音神經性聽力受損，且出現至少兩個頻率聽力下降為20 dBHL的一種疾病[1,2]。突發性耳聾患者以單側發病較為多見，少數患者為雙側發病，患者常伴有不同程度的眩暈、耳鳴等癥狀，嚴重影響患者的生活質量，同時也造成極大的痛苦[3]。微小RNA-431(microRNA-431，miR-431)是存在于生物體內的一種非編碼小RNA，研究顯示，miR-431在多種疾病中發揮重要作用[4,5]。Eya4(Eye absent 4)是eya家族的成員之一，相關研究顯示，Eya4基因突變與遺傳性耳聾密切相關[6,7]。然而，目前血清miR-431、Eya4的表達與突發性耳聾的發病機制及其與耳蝸功能的關系尚不完全清楚。基于此，本研究擬通過檢測突發性耳聾患者血清miR-431、Eya4的表達情況，探究其表達水平與突發性耳聾患者耳蝸功能的關系，以期為臨床診斷及治療突發性耳聾提供有價值的參考依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年11月至2020年1月本院耳鼻喉科收治的突發性耳聾患者65例為突發性耳聾組，男37例，女28例；年齡21～60歲。同期選取在本院進行常規體檢的健康人群70例為對照組，男39例，女31例；年齡20～61歲。2組性別比、平均年齡、體質量指數(body mass index，BMI)、舒張壓及收縮壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。該研究經本院道德倫理委員會批準通過，樣品采集均取得患者及家屬知情并簽署同意書，且符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。見表1。

表1 2 組基本資料比較

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)符合2005年制定的《突發性耳聾的診斷和治療指南》中有關突發性耳聾的相關診斷標準[8]；(2)患者及家屬選擇在本院進行治療者；(3)臨床資料完整者。排除標準：(1)同時患有心、腎、肝功能不全者；(2)由于外耳和中耳疾病等因素所致的耳聾者；(3)由于大前庭水管綜合征等病因所致的聽力下降者。

1.3 主要試劑與儀器 離心機(貨號：wi82487)，購自于北京若水合科技有限公司；總RNA提取試劑盒(貨號：20310)，購自于北京甘棠飛華生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號：AORT-0020)，購自于上海伯易生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(貨號：V115896)，購于美國Applied Biosystems公司；miR-431、Eya4以及內參U6引物，由上海杏園瑞民生物工程有限公司合成；本研究中其他化學藥品均購自上海銳塞生物技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集及保存:血清樣品：于清晨抽取所有受試者空腹狀況下的靜脈血4 ml，3 000 r/min(4℃)離心分層后收集上層血清，置于-20℃冰箱中保存待測。

1.4.2 血清miR-431、Eya4表達水平檢測:采用實時熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測2組研究對象血清miR-431、Eya4的表達水平。具體操作步驟：取出待測血清，用總RNA提取試劑盒并嚴格按照說明書順序提取總RNA，然后經逆轉錄得到cDNA。以逆轉錄合成的cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測。PCR反應條件：94℃，2 min；94℃，30 s；60℃，30 s；74℃，35 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算血清miR-431、Eya4相對表達量。

1.5 耳蝸功能評定 患者入院后由專門醫生對其耳蝸功能進行診斷，若患者蝸性聽力下降或損失為耳蝸功能異常，反之耳蝸功能正常。

2 結果

2.1 2組研究對象血清miR-431、Eya4表達水平 突發性耳聾組血清miR-431表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；血清Eya4表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2 組血清中miR-431 、Eya4 表達水平

2.2 血清miR-431、Eya4對突發性耳聾的診斷價值 ROC結果顯示，血清miR-431、Eya4診斷突發性耳聾的AUC分別為0.795、0.746，截斷值分別為1.234、0.990，此時對應靈敏度分別為72.3%、87.7%，特異性分別為80.0%、57.1%。血清miR-431、Eya4聯合檢測突發性耳聾的AUC為0.811，此時對應靈敏度和特異性分別為73.8%、78.6%。見表3，圖1。

表3 血清miR-431 、Eya4 表達水平對突發性耳聾診斷價值比較

圖1 血清miR-431、Eya4對突發性耳聾的診斷價值

2.3 血清miR-431、Eya4表達與患者耳蝸功能的關系 以血清miR-431、Eya4的截斷值將突發性耳聾患者分組，其中高miR-431組39例，低miR-431組26例；高Eya4組29例，低Eya4組36例。高miR-431組患者耳蝸功能異常發生率明顯高于低miR-431組(P<0.05)；高Eya4組患者耳蝸功能異常發生率顯著低于低Eya4組(P<0.05)。見表4。

表4 4 組患者耳蝸功能的比較 例(%)

2.4 影響突發性耳聾患者耳蝸功能的相關因素分析 以突發性耳聾患者耳蝸功能異常是否發生為因變量(0=否，1=是)，血清miR-431、Eya4表達水平為自變量，采用Logistic回歸分析，結果顯示：血清miR-431高表達、Eya4低表達是影響突發性耳聾患者發生耳蝸功能異常的獨立危險因素(OR=3.142,95% CI：1.161～8.504；OR=0.020,95% CI：1.146～4.924,P<0.05)。見表5。

表5 突發性耳聾患者耳蝸功能異常的危險因素分析

3 討論

突發性耳聾以無明顯原因、突然發生為臨床特征。該疾病的主要臨床表現為患者聽力下降，同時伴有眩暈、惡心嘔吐、耳鳴、耳堵塞感等[9,10]。目前90%左右的突發性耳聾患者病因不明，給治療帶來一定困難，且對患者預后造呈嚴重影響[11]。因此，對其發病理機制進行深入研究，以尋找新的疾病標志物，對早期診斷及治療具有重要的臨床意義。

miR-431是位于14q32 miRNA基因簇中的一種小分子RNA，相關研究顯示，miR-431主要分布于骨骼肌中，在骨骼肌分化、再生等多種生物學活性中發揮重要作用[12,13]。沈艷青等[14]通過探究miR-431在肺發育形態學中的潛在作用，結果發現，miR-431在肺發育過程中可能起重要的負向調控作用。Yang等[15]研究發現，miR-431在子癇前期胎盤中高表達，可能通過靶向ZEB1抑制了滋養細胞的遷移和侵襲，引起子癇前期發作。本研究結果顯示突發性耳聾組血清miR-431表達水平顯著高于對照組，提示miR-431可能參與突發性耳聾的發展進程，但有待進一步證實。

Eya4是一種編碼轉錄激活因子相關蛋白，位于6q23.2上，由640個氨基酸組成[16,17]。Eya4在胚胎發育過程中發揮重要作用，且其突變與擴張型心肌病、多種惡性腫瘤及遺傳性耳聾等密切相關[18,19]。吳楷文等[6]研究發現，目前世界范圍內報道與耳聾相關Eya4的18種致病突變中，多數引起Eya4翻譯被提前終止，是Eya4下調，導致患者出現聽覺障礙。樊悅[20]研究發現，miR-431高表達可能通過抑制靶基因Eya4的翻譯，使Eya4蛋白形成受阻，進一步影響螺旋神經節細胞分化，最終導致聽力障礙。本研究結果顯示，突發性耳聾組血清Eya4表達水平顯著低于對照組，提示可能由于miR-431高表達抑制了Eya4的形成進而參與突發性耳聾的發生發展。本研究中ROC曲線分析表明，血清miR-431、Eya4診斷突發性耳聾的AUC分別為0.795、0.746，提示血清miR-431、Eya4可作為評估突發性耳聾發生的指標，且miR-431表達水平對突發性耳聾的診斷價值較Eya4高。進一步分析發現，兩者聯合檢測突發性耳聾的AUC為0.811，提示兩者聯合診斷價值高于單獨診斷。本研究還發現，高miR-431組患者耳蝸功能異常發生率明顯高于低miR-431組，高Eya4組患者耳蝸功能異常發生率顯著低于低Eya4組，提示血清miR-431高表達、Eya4低表達與突發性耳聾患者耳蝸功能密切相關。此外，Logistic回歸分析結果顯示：血清miR-431高表達、Eya4低表達為突發性耳聾患者發生耳蝸功能異常的獨立危險因素，提示監測兩者表達水平，對評估突發性耳聾患者發生耳蝸功能異常有一定的臨床價值。

綜上所述，miR-431在突發性耳聾患者血清中的表達水平明顯升高，Eya4表達水平明顯降低，兩者對突發性耳聾具有一定診斷價值，且其表達水平與患者耳蝸功能異常密切相關，提示血清miR-431、Eya4可作為評估突發性耳聾患者病情及耳蝸功能的潛在生物學指標，但其具體的作用機制還有待深入研究。