MTHFR MTRR基因多態性及血同型半胱氨酸水平與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性

許小偉 謝海洋 秦延昆 邵祥忠 曹 建

腦梗死是臨床常見的一種腦血管病癥，主要是由于腦供血突然中斷引起，可由動脈粥樣硬化誘發。血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平與動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的發生發展存在密切聯系。亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)是影響Hcy代謝水平的關鍵作用酶。目前，關于MTHFR基因及MTRR基因、血漿Hcy水平、頸動脈粥樣硬化性腦梗死三者的關系尚存在一定的爭議，部分學者認為MTHFR基因及MTRR基因發生突變，可導致血漿Hcy水平顯著提高，而高水平Hcy可引發頸動脈內彈力層斷裂，誘導血管平滑肌細胞遷移增殖，改變血小板功能及凝血系統，最終誘發動脈粥樣硬化。亦有學者認為MTHFR基因突變雖然可導致血漿Hcy水平提高，但其和動脈粥樣硬化性腦梗死并無顯著相關性。因此，本研究主要探究MTHFR、MTRR基因多態性及血Hcy水平與ACI的相關性，旨在為ACI的臨床防治提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2020年10月就診于海安市人民醫院的45例ACI患者作為觀察組，另選取同期于海安市人民醫院進行健康體檢、并經頸動脈彩超檢查證實無動脈粥樣硬化的非ACI體檢者40例作為對照組。兩組研究對象性別、年齡、身體質量指數(body mass index, BMI)、吸煙、飲酒、糖尿病及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患病情況，差異均無統計學意義(

P

>0.05)，觀察組高脂血癥及高血壓比例高于對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

續表1

1.2 納入和排除標準 納入標準：①參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中ACI診斷標準，觀察組患者均確診為腦梗死；②參照急性卒中治療低分子肝素試驗(trial of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST)分型標準和經頸動脈彩超檢查，觀察組患者均確診為大動脈粥樣硬化性腦梗死；③臨床資料完整的受試者；④受試者或家屬均簽定知情同意書。

排除標準：①合并腫瘤、惡性貧血、甲狀腺疾病、肝腎功能障礙、慢性胃腸道疾病等影響Hcy水平的疾??；②合并嚴重心臟疾??；③近期服用過葉酸、茶堿、甲氨蝶呤等；④中途退出研究者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本DNA的采集和基因分型 所有研究對象抽取空腹肘靜脈血1 mL，置于抗凝管中，采用基因組DNA提取試劑盒(上海博升生物科技有限公司)，按照操作說明提取受試者DNA。采用Taqman-MGB探針法對MTHFR 677C/T(rs1801133)、MTHFR 1298A/C(rs1801131)、MTRR 66A/G(rs1801394)基因多態性進行檢測，所用試劑和儀器均由上海恒斐生物科技有限公司提供。再分別對上述三個位點行熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，其反應體系的總體積均為10 μL，包括了1 μL 20 ng/μL DNA模板、5 μL 2×TaqMan Universal Master Mix、0.5 μL 20×TaqManMGB探針、3.5 μL去離子水。在95℃ 10 min條件下反應，95℃ 15 s、60℃ 1 min條件下擴增，共20個循環；最后在89℃ 15 s、60℃ 90 s條件下擴增，共30個循環。待反應結束，即在熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)儀(美國ABI公司，型號：7900)對樣本孔終點熒光進行讀取，通過分析軟件對各樣本基因分型的結果進行確定。

1.3.2 血Hcy的檢測 所有研究對象入組后，抽取空腹肘靜脈血4 mL，置于EP管內，在常溫下靜置1 h后，采用離心法分離血清，于-80℃保存待測。采用自動生化分析儀(江蘇英諾華醫療技術有限公司)檢測Hcy水平。

1.4 資料整理和觀察指標 收集兩組研究對象一般資料，包括性別、年齡、吸煙、飲酒、高脂血癥、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、血Hcy水平，以及MTHFR、MTRR基因型分布情況等。①比較兩組MTHFR和MTRR基因型分布情況；②比較兩組血Hcy水平；③分析ACI發生的獨立危險因素。

2 結果

2.1 兩組研究對象MTHFR和MTRR基因型比較 觀察組對象MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型與對照組存在差異(

P

<0.05)，而兩組對象MTHFR rs1801131基因型差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象MTHFR和MTRR基因型分布情況比較[例(%)]

2.2 兩組研究對象血Hcy水平的比較 觀察組血Hcy水平為(18.02±0.62)μmol/L，對照組為(7.35±0.10)μmol/L，差異具有統計學意義(

t

=13.864，

P

<0.001)。2.3 ACI發生的多因素分析 將單因素分析有差異的因素納入多因素logistic回歸分析中，包括高脂血癥、高血壓、血Hcy水平、MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型，賦值見表3。結果顯示，高脂血癥、高血壓、血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI發生的獨立危險因素(

P

<0.05)。見表4。

表3 ACI危險因素logistic回歸分析變量賦值表

表4 ACI危險因素logistic回歸分析

3 討論

我國ACI發病率呈上升趨勢，嚴重威脅人民群眾身體健康和生命安全。高水平Hcy是多種心腦血管疾病發病的獨立危險因素，當Hcy水平異常升高、MTHFR和MTRR發生基因突變時，即會引發高水平Hcy。本研究就MTHFR和MTRR基因多態性及血Hcy水平與ACI疾病發生的相關性進行分析，以期為預防ACI的發生提供參考。

目前，關于ACI發病的危險因素研究較多，但不同學者結果不盡相同，笪正等通過回顧性分析446例急性腦梗死患者的臨床資料，發現急性腦梗死發病與患者年齡、基線收縮壓、卒中嚴重程度、C反應蛋白以及責任動脈閉塞關系密切。劉磊等通過分析78例急性腦梗死的臨床資料，發現血清超敏C反應蛋白、纖維蛋白原、低密度脂蛋白是急性腦梗死發病的危險因素，其中血清超敏C反應蛋白可作為急性腦梗死患者病情嚴重程度的判定指標。然而大多數研究并未將MTHFR和MTRR基因型納入急性腦梗死危險因素分析中。本研究結果顯示，高脂血癥、高血壓是ACI發生的獨立危險因素，其中高血脂是動脈內斑塊形成、動脈粥樣硬化及動脈管腔狹窄的重要原因，而高血壓可加大動脈壁環狀擴展范圍，提高顱內動脈壁剪應力，進而改變張應力和血流，最終誘發動脈粥樣硬化形成，針對ACI發病高危人群，應當平穩的控制血壓及血脂水平。

本研究結果顯示，血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因亦是ACI發生的獨立危險因素，Hcy是機體蛋氨酸代謝過程中所產生的一種含硫氨基酸，雖然目前發現血漿Hcy水平與腦梗死患者神經功能缺損程度、腦梗死分型無明顯相關性，但證實高水平Hcy是腦血栓形成獨立危險因素。高水平的Hcy引發ACI的機制較為復雜，包括損傷腦血管內皮細胞、增加顱內動脈遠端阻力、影響凝血纖溶系統、促進脂質過氧化反應、促進平滑肌細胞增殖等。而MTHFR是Hcy再甲基化成為蛋氨酸代謝過程中的關鍵酶，MTHFR C677T基因突變的純合子TT可降低MTHFR活性，引起血Hcy水平的升高，促進高水平Hcy的發生及發展，最終誘導ACI的發生。其等位基因與動脈中彈力層的斷裂發生密切相關，在動脈粥樣硬化的形成中，T基因能夠將平滑肌細胞遷至內膜，對ACI的發生及發展起到了促進作用。MTRR基因位于5p15.2～15.3，主要多態性即為66A→G，即異亮氨酸取代了蛋氨酸，MTRR參與了蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)活性的恢復，其能夠有效維持細胞中四氫葉酸和蛋氨酸水平，而MS又是機體代謝Hcy的關鍵酶，因此MTRR發生基因突變也會引起Hcy水平異常升高，繼而促進ACI的發生。

綜上所述，高脂血癥、高血壓、高水平Hcy、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI發生的獨立危險因素，臨床應采取針對性預防干預措施，以降低ACI的發生風險。然而本研究樣本量較小，結果仍需大樣本、高質量、多中心研究進一步證實。此外MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是否能通過其他途徑影響ACI的發生及發展仍需進一步探索。