明膠基生物墨水在藥學研究中的應用

陳俊根，張雷，何原子，張峻穎，吳春勇

(1.中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009;2.中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 211198;3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101；4.中國藥科大學中藥制劑教研室，江蘇 南京 211198)

新藥研究領域一般通過臨床前動物試驗評價其成藥性，但由于種屬差異的存在，結果外推到人體存在很大的不確定性[1]。因此，基于人源細胞開發人體體外模型具有重要意義。目前藥物篩選最常用的體外模型是二維(2D)細胞培養，具有易操作、生長環境可控、細胞生長可視化、重現性好、高通量等優點[2]，但由于缺乏細胞-細胞間、細胞-基質間相互作用，可能誤導藥物作用的預測[3-4]。研究發現，三維(3D)體外模型可以更好地模擬體內復雜的微環境，為新藥篩選提供更可靠的開發策略與技術平臺。但傳統3D體外模型的構建方法，如剛性支架[7]、旋轉瓶[8]、懸滴[9]、超低黏附培養[10]和微孔陣列[11]等忽略了細胞外基質的作用，不利于重現細胞在體內的微環境[12]，模型尺寸也受到很大限制[13]。更為重要的是，復雜的3D類器官需要更精確的多細胞結構以及血管網絡的整合，而傳統的組織工程技術無法滿足這些要求[14-16]。

3D生物打印是一種新興的、革命性的組織工程技術，將生物材料按照預先設計好的模型，以自動化方式層層打印，可以構建結構復雜、功能成熟的人體類器官，為新藥評價提供與體內功能更相似的體外模型[17-18]。生物打印技術可分為4類：擠出型打印(extrusion-based bioprinting)、噴墨型打印(inkjet-based bioprinting)、立體光刻(projection stereolithography)以及激光誘導轉移打印(laser induced forward transfer)[19](見圖1)。其中，擠出型打印技術是性能最全面，也是應用最為廣泛的生物打印技術[20]。打印時所用的充滿細胞的水凝膠被稱為生物墨水，也就是具有良好的打印活細胞能力的生物材料配方，是生物打印的核心[21]。

圖1 4種常用的的生物打印技術(已獲得引用許可)

目前常用的生物墨水主要分為天然多聚物及其取代物，以及合成的高聚物[22]。常用的天然多聚物包括明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、海藻酸鈉等，合成的高聚物多來源于水凝膠材料，包括聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)等。明膠是生物打印領域常用的生物材料，與膠原蛋白、纖維蛋白等天然基質相比，明膠價格低廉、更容易獲得；與合成聚合物相比，明膠能夠提供細胞黏附生長的位置以及緩慢水解與酶解特性。近年來，隨著脫細胞基質提取技術的成熟，與人體內生物基質環境更接近的脫細胞基質(dECM)有望在生物打印中成為主流材料[23]，但不穩定的材料來源限制了dECM的廣泛應用[24]。因此，盡管性質優良的新型材料不斷出現，但由于低廉的成本、優越的生物化學和生物力學性質，明膠基生物墨水仍然是生物打印領域最常用的墨水配方。此外，明膠修飾物甲基丙烯酰明膠(GelMA)的合成方法日趨成熟，可以在不同的材料來源、不同實驗室實現穩定的產率。目前，基于明膠基或GelMA基生物墨水打印的3D體外模型在新藥篩選和毒性評價領域日益受到關注。

1 基于明膠的生物墨水

1.1 組織工程中的明膠 根據制備工藝的不同，明膠可分為A、B兩種類型，B型明膠較A型明膠黏度更高[25-27]。根據來源的不同，明膠可分為魚皮來源和哺乳動物來源，由于魚皮來源明膠的膠凝溫度低，機械性能差[28]，組織工程中多使用哺乳動物來源。明膠具有多種優良的物理性質，包括：①生物相容性；②可溫度編程特性；③高度分散性；④持水性；⑤可降解性，因此基于明膠的生物墨水在3D生物打印中得到了極為廣泛的應用[29]。然而，生物打印很少單獨使用明膠溶液作為生物墨水，這是由于其較差的機械支撐能力和缺乏溫和有效的交聯手段[30]。為了解決這些難題，人們加入交聯條件溫和的交聯劑作為改性劑，同時改善明膠的機械特性以獲得良好的可打印能力。

1.2 明膠與改性劑的結合 海藻酸鈉是一種天然多糖，溶于水形成高黏度溶液，在鈣離子的存在下通過離子交聯作用形成穩定的水凝膠，強度隨著鈣離子濃度的增大以及交聯時間的延長而增強[31]。形成的交聯結構可被螯合劑EDTA解交聯，極大方便了藥物孵育后的細胞收集與分析[32]。但海藻酸鈉不具備明膠的水解特性，其高親水特性不利于細胞的黏附生長[33-34]。為此，人們在明膠中加入海藻酸鈉，結合明膠的可溫度編程特性與海藻酸鈉的黏度及交聯能力，形成具有優良打印特性的混合生物墨水[35]。Xie等[36]使用來源于不同肝癌患者個體的原代肝癌細胞，基于明膠-海藻酸鈉墨水，打印的個性化肝癌模型對索拉菲尼等4種肝癌一線藥物表現出不同的抗藥性，在個性化藥物篩選領域展現出良好的應用前景。

海藻酸鈉的加入雖然改善了明膠墨水的可打印性，但是添加單改性劑的混合生物墨水與體內細胞生長的細胞外基質環境仍相差較遠[37]。纖維蛋白原是一種常用的添加材料，可以起到補充ECM和增強交聯穩定性的作用。Zhao等[38]在明膠-海藻酸鈉的配方中加入了纖維蛋白原，打印的大鼠肝臟類器官能保持良好的肝細胞活力，與2D培養相比，此模型對抗癌藥表現出更高的耐藥性，能夠更真實反映藥物的體內藥效。Zhao等[39]使用明膠-海藻酸鈉-纖維蛋白原的混合生物墨水，裝載HeLa細胞打印的3D模型相較于2D模型，對紫杉醇表現出更高的耐藥性。Dai等[40]添加纖維蛋白原，以CaCl2和轉谷氨酰胺酶(TG)作為交聯劑，裝載膠質瘤干細胞(SU-3)打印的3D模型對替莫唑胺具有更強的耐藥性。MatrigelTM是一種商品化的與體內基質環境類似的凝膠材料。Mao等[41]在明膠-海藻酸鈉基礎上加入MatrigelTM以模擬細胞外基質(ECM)，裝載人原代肝內膽管腫瘤細胞后，打印的腫瘤模型對順鉑、5-氟尿嘧啶、索拉菲尼可以表現明顯的耐藥性。

由于人體內ECM成分復雜，研究者還嘗試加入人源的脫細胞基質(hECM)，以更好地模擬體內的細胞-基質相互作用[35，42-43]。Hiller等[35]采用明膠-海藻酸鈉-hECM混合生物墨水，打印了人肝祖細胞(HepaRG)，由于提供了更多的細胞黏附生長位點，此人體肝臟類器官模型的代謝活性較2D單層培養明顯增強，且支持體外的腺病毒轉染，為抗病毒藥物的篩選提供了技術手段。

除海藻酸鈉外，明膠與其他材料的結合可以打印出復雜的管腔結構。Homan等[44]將纖維蛋白作為添加劑與明膠組成混合生物墨水，以泊洛沙姆(Pluronic)為犧牲材料，用于體外腎小管模型的構建，對腎毒性藥物環孢菌素表現出劑量依賴性的屏障破壞，可用于體外腎毒性藥物的篩選(見圖2)。

圖2 a.近曲小管示意圖；b.生物打印近曲小管示意圖

2 基于修飾化明膠的生物墨水

2.1 GelMA生物墨水 與添加交聯劑進行物理交聯相比，通過化學修飾獲得光交聯能力的GelMA能夠實現更加快速、均勻的原位交聯[45]。GelMA是一種明膠修飾產物，由明膠分子上的氨基與小分子的甲基丙烯酸酐在堿性條件下結合形成，此反應適用于A型和B型明膠[46-47](見圖3)。在長波長紫外線(UV)照射下，GelMA能夠與2-羥基-4′-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯乙酮(Irgacure 2959)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸鋰(LAP)等水溶性光引發劑形成穩定水凝膠。通過控制氨基被取代的程度，可以得到不同機械特性的水凝膠[48-50]。Xie等[51]使用純GelMA生物墨水，結合噴墨打印技術構建了3D腫瘤陣列芯片，與2D培養相比，對阿霉素和紫杉醇表現出更高的耐藥性。Bhise等[52]使用GelMA包裹HepG2，打印于微流控芯片上，紫外照射后組裝芯片灌流培養，構建的3D肝臟模型可以在30 d內保持正常功能，采用高濃度對乙酰氨基酚孵育后，出現明顯的毒性反應。

圖3 GelMA的合成方法示意圖(已獲得引用許可)

2.2 GelMA墨水與改性劑的結合 在獲得新的光交聯能力的同時，GelMA仍保留了明膠的低黏度特性，因此必須對打印過程中的黏度進行控制。為此，海藻酸鈉被用于增強GelMA溶液的黏度，從而優化其可打印性。通常與同軸雙層或多層噴頭聯用，載細胞的GelMA-海藻酸鈉墨水由中心擠出，CaCl2溶液同時由外層擠出，以原位交聯提高打印的保真度[53]。此混合生物墨水裝載HUVEC細胞打印后，進行心肌干細胞接種，得到的心臟類器官模型對阿霉素表現出明顯的劑量依賴毒性，可用于心臟毒性藥物的體外篩選。

2.3 GelMA墨水與犧牲材料的結合 近年來，越來越多的研究將GelMA與犧牲材料結合，從而優化打印策略，構建更加復雜的血管網絡結構，以提供更加可靠的體外藥物篩選或毒性評價模型。Ouyang等[54]將明膠作為犧牲材料與GelMA聯用，進行無縫隙的生物材料沉積，灌流管路37 ℃加熱去除明膠后，得到了具有管狀幾何形狀的復雜3D網絡結構。Kolesky等[55]使用可溫度編程的生物材料泊洛沙姆(Pluronic-F127)作為犧牲材料，以GelMA為生物墨水，結合聚二甲基矽氧烷(PDMS)生物材料，采用多噴嘴打印出微通道。Massa等[56]使用GelMA墨水，以瓊脂作為犧牲材料，裝載人肝癌細胞(HepG2)和HUVEC細胞打印了具有血管網絡結構的肝臟模型，并用于藥物肝毒性的篩選(見圖4)。

圖4 a.血管化肝結構示意圖；b.具有可灌注血管結構的3D肝組織結構的制造(已獲得引用許可)

3 小結

基于明膠獨特的理化性質、出色的生物學特性以及適用于多種打印技術的靈活性，人們結合海藻酸鈉、纖維蛋白、MatrigelTM等改性劑，開發了多種基于明膠的生物墨水，生物打印了過去難以實現的復雜組織結構。與2D傳統模型相比，打印的體外類器官模型在藥物篩選和毒性評價等研究中表現出更高的預測性。隨著生物材料研究的不斷深入，有望開發出具有更佳打印特性的明膠基生物墨水，結合不斷進步的生物打印策略，優化細胞來源，可以打印形狀與功能上與人體組織器官更加接近的3D組織類器官，在新藥篩選領域發揮更大的作用。