99Tcm標記基于體內無銅點擊化學的葡萄糖代謝顯像劑

陳慶鑫，褚泰偉

(北京大學 化學與分子工程學院，放射化學與輻射化學重點學科實驗室，北京 100871)

葡萄糖是糖在血液中的運輸形式并能在體內氧化供能，在機體糖代謝中占據主要地位。惡性腫瘤細胞的異常增殖需要大量葡萄糖[1]，葡萄糖代謝旺盛的部位極有可能是潛在的腫瘤病灶。因此，葡萄糖代謝顯像的臨床意義重大。

氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)是目前研究最多的正電子葡萄糖代謝顯像劑[2-4]，然而正電子發射計算機斷層掃描(PET)及加速器售價昂貴。故此，研究和發展新型的非加速器核素制備的葡萄糖代謝顯像劑仍是一項十分重要的工作。

由于放射性核素99Tcm具有良好的物理性能(t1/2=6 h，Eγ=140 keV)，而且價格低廉、來源廣泛，所以99Tcm是單光子發射計算機斷層顯像技術(SPECT)診斷中常見的放射性核素。

然而，以往報道的99Tcm標記葡萄糖代謝顯像劑都是先將葡萄糖和有機配體偶聯，再與放射性核素99Tcm配位，形成一個體積龐大的分子探針。這種體積龐大的放射性核素及有機配體對葡萄糖基團有很大影響，偶聯物體積龐大也是造成其生物評價效果不佳的主要原因[5-8]。 比如，Yang等[6]將一個N2S2配體與葡萄糖分子偶聯(即ECDG)，該化合物可以與99Tcm形成穩定配合物；99Tcm-ECDG的動物體內分布實驗發現，該化合物具有良好的瘤肉比，但血中放射性活度一直是腫瘤的兩倍，不利于顯像。分析可能的原因是該化合物可以被葡萄糖轉運體識別，但無法被細胞內的己糖激酶磷酸化，所以很快被排出細胞外。

環辛炔與疊氮的[3+2]環加成點擊反應[9]，具有在生物體系內反應速度快、無副反應發生等優點，有可能解決上述99Tcm標記的葡萄糖代謝顯像劑存在的缺點[10-13]。

本工作旨在將點擊化學應用到“預著靶-再快速、高效尋靶”的放射性葡萄糖代謝顯像中，合成只含有小體積的疊氮基團的葡萄糖衍生物，首先完成葡萄糖基團在體內的預著靶，然后注射放射性核素標記的環辛炔探針進行再尋靶，通過高效體內點擊反應實現葡萄糖代謝顯像。

1 試劑與儀器

二苯并環辛炔、丁二酸單甲酰氯、三溴吡啶嗡、叔丁醇鉀、N-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、乙二醇雙2-氨基乙基醚、2-氨基乙硫醇、三苯甲醇、溴乙酰溴、溴乙酸乙酯、D-葡萄糖胺鹽酸鹽、4-溴丁酸乙酯：百靈威科技有限公司；鹽酸羥胺、正辛醇：北京化工廠；苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽：吉爾生化(上海)有限公司；疊氮化鈉：浙江東陽市凱明特種試劑有限公司；溴乙酸、3-溴丙酸、草酰氯：國藥集團化學試劑有限公司；99Mo-99Tcm核素發生器：原子高科股份有限公司提供。

Bruker AVANCEⅢ(550 MHz)核磁共振儀、Bruker APEX Ⅳ FTMS 質譜儀：瑞士Bruker公司；Wizard Ⅱ 2470 series 自動伽馬計數器：美國Perkin Elmer公司；Waters 1525 Binary HPLC Pump高效液相色譜儀：美國Waters公司。

2 實驗動物

健康雄性昆明小鼠:清潔級普通動物，體重(20±2) g，由中國科學院動物所提供。向其左側腋部皮下移植約106個S180細胞，小鼠肉瘤S180細胞株由北京大學生命科學學院提供。飼養在開放衛生環境里7～8 d后，腫瘤直徑約10～15 mm時用于實驗。實驗前小鼠禁食16 h以上。

3 實驗部分

3.1 標記前體的合成

ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的結構示意圖示于圖1。

圖1 ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的結構示意圖Fig.1 Structure of ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

(1) Gordon等[14]研究發現，具有雙苯并的環辛炔化合物反應更為靈敏、反應速度更快。故參考文獻[15-16]類似方法合成了含有二苯并環辛炔功能團的MAMA配體(ADIBO-MAMA)。

(2) 參照文獻[17-21]合成了2位含有疊氮基且碳鏈長度不等的一系列葡萄糖衍生物(N3-DG-1～4)。

3.2 體外點擊速率常數的測定

參照文獻[22]報道的方法，測定四種2-疊氮葡萄糖化合物和ADIBO-MAMA在生理溫度下的體外點擊反應速率常數。分別配制化合物ADIBO-MAMA(10-3mol/L)、 N3-DG-1～4(2.0×10-2mol/L)的甲醇溶液。各取50 μL，加入400 μL甲醇后于37 ℃反應；取不同時間點的混合液由HPLC測定化合物ADIBO-MAMA的紫外吸收峰(254 nm)面積A。根據In(C0/C)=In(A0/A)=K1t，線性擬合求出一級動力學速率常數K1；再結合K1=K2×C0(N3-DG)，進而求出二級動力學速率常數K2。其中，C0為ADIBO-MAMA溶液初始濃度，C為ADIBO-MAMA溶液時刻t的濃度；A0為ADIBO-MAMA初始峰面積，A為ADIBO-MAMA時刻t的峰面積。

3.3 99Tcm-ADIBO-MAMA的制備及性質測定

99Tcm-ADIBO-MAMA參照相關文獻[23]報道的方法制備。利用三氟乙酸(TFA)和三乙基硅烷對ADIBO-MAMA配體化合物中巰基基團上的三苯甲基進行脫除，然后脫保護后的配體(“N2S2”配體)與中間配合物—99Tcm標記的葡庚糖酸鈉(99Tcm-GH)通過配體交換反應制得99Tcm-ADIBO-MAMA。

(1) 中間配合物99Tcm-GH的制備

取GH水溶液(0.1 mL，0.1 g/mL)，加入SnCl2·2H2O的鹽酸(0.1 mol/L)水溶液(10 μL，2 g/L)，振蕩混勻后利用氫氧化鈉水溶液(0.1 mol/L)調節pH至中性(14.5 μL)；加入Na99TcmO4(活度約3.7×107Bq)，渦旋混合2 min，室溫放置反應10 min，得到中間配合物99Tcm-GH，利用radio-HPLC測定其放化純度。

(2)99Tcm-ADIBO-MAMA的制備

取1.0 mg ADIBO-MAMA溶于0.1 mL苯甲醚和0.4 mL無水甲醇， 冰水浴下加入100 μL TFA，反應2 min后加入50 μL三乙基硅烷，攪拌反應10 min；旋干，加入0.5 mL無水乙醇溶解稀釋，充入少量氬氣保護巰基；加入99Tcm-GH，振蕩混勻，100 ℃下反應5 min，制得99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液儲備液；冷卻至室溫，利用radio-HPLC測定其放化純度。動物實驗中，將99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液儲備液，利用生理鹽水稀釋至20%乙醇溶液。

(3) 標記物的理化性質測定

標記物穩定性測定。常溫下，標記物在空氣中放置8 h；于不同時間取樣利用radio-HPLC測定樣品，分析標記物放化純度的變化，評價其自身穩定性。

脂水分配系數的測定。取0.1 mL標記物儲備液，加入到裝有0.9 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)和1.0 mL正辛醇的離心管中，在室溫下渦旋混合5 min，在2 000 r/min轉速下離心5 min；從水相和有機相中分別取0.1 mL樣品溶液，利用 Wizard Ⅱ 2470 series自動伽馬計數器測定其放射性計數NW(水相中的計數)和NO(有機相中的計數)，根據脂水分配系數計算公式LogP(O/W)=Log(NO/NW)，計算得出標記物的脂水分配系數。平行三次，取平均值。

3.4 小鼠體內分布

取健康雄性昆明小鼠，以99Tcm-ADIBO-MAMA作為空白對照。預著靶策略：N3-DG-1或N3-DG-2(0.02 mol/L，0.1 mL)在小鼠腫瘤組織著靶2 h后，尾靜脈注射99Tcm-ADIBO-MAMA(比活度約0.5 MBq/mL，0.1 mL)，通過體內點擊反應進行尋靶。動物實驗過程為：荷瘤小鼠尾靜脈注射標記物后1、2、4、8 h，進行眼眶取血，斷頸處死，解剖，取腦、肌肉、腫瘤、心、骨、胃、腸、腎、脾、肺和肝，清除內容物，清水洗滌，拭干，稱重，自動伽馬計數器分別測其放射性活度，計算每克組織器官占注射劑量的百分比(%ID/g)以及腫瘤與血液(T/B)、腫瘤與肌肉(T/M)的放射性攝取比值。每組五只小鼠，最終結果表示為(平均值±標準偏差)。使用SPSS 26.0(Statistical Product and Service Solutions 26.0)分析數據之間差異的顯著性。

4 結果與討論

4.1 化合物鑒定

實驗中合成的化合物均通過1H NMR、13C NMR檢測，結果顯示均為目標產物。

ADIBO-MAMA1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 7.42-7.33(m,15H),7.26(s,4H),7.22(s,4H),7.21-7.14(m,8H),7.13-7.05(m,5H),3.80(s,2H),3.53-3.43(m,9H),3.36(dt,J=15.5,5.0 Hz,4H),3.07-2.93(m,6H),2.57-2.22(m,10H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 144.68,144.59,130.26,129.57,129.54,128.87,128.71,128.54,128.00,127.96,127.63,127.50,126.86,126.77,97.64,70.26,70.15,69.88,69.56,67.09,66.84,60.37,55.94,53.00,39.24,38.94,38.19,31.97,31.36,30.78。

N3-DG-11H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.56(d,J=8.6 Hz,1H),5.14-5.00(m,2H),4.30(dt,J=12.6,4.3 Hz,1H),4.14-4.05(m,1H),3.81(ddd,J=9.7,4.5,2.2 Hz,1H),3.70-3.60(m,1H),2.19(s,3H),2.09(d,J=3.7 Hz,3H),2.08(s,3H),2.03(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.50,169.75,169.60,168.53,92.61,72.80,72.76,67.88,62.64,61.45,20.86,20.67,20.62,20.54。

N3-DG-21H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.45(d,J=9.3 Hz,1H),5.80(d,J=8.7 Hz,1H),5.26(dd,J=10.4,9.4 Hz,1H),5.14(t,J=9.6 Hz,1H),4.32-4.25(m,1H),4.22(dd,J=10.3,9.2 Hz,1H),4.18-4.10(m,1H),3.91(s,2H),3.88-3.81(m,1H),2.12(s,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.90,170.59,169.28,169.25,167.02,92.25,72.96,72.20,67.78,61.65,53.28,52.63,20.84,20.68,20.56,20.55。

N3-DG-31H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.21(d,J=3.6 Hz,1H),5.75(d,J=8.9 Hz,1H),5.24(dt,J=23.9,9.6 Hz,2H),4.50(td,J=10.4,3.6 Hz,1H),4.30-4.22(m,1H),4.07(dd,J=12.4,2.2 Hz,1H),3.66-3.50(m,3H),2.38-2.31(m,2H),2.20(s,3H),2.09(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.79,170.64,169.90,169.06,168.55,90.51,77.27,77.01,76.76,70.59,69.80,67.48,61.55,51.26,47.13,35.70,20.85,20.79,20.65,20.53。

N3-DG-41H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.93(dd,J=33.1,10.3 Hz,1H),5.73(d,J=8.8 Hz,1H),5.23(dd,J=10.5,9.5 Hz,1H),5.13(t,J=9.7 Hz,1H),4.38-4.22(m,2H),4.14(dd,J=12.5,2.2 Hz,1H),3.86(ddd,J=9.9,4.7,2.3 Hz,1H),3.32(t,J=6.5 Hz,2H),2.30-2.16(m,2H),2.11(d,J=3.7 Hz,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H),1.94-1.77(m,2H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.89,171.23,170.69,169.46,169.35,92.52,72.86,72.57,67.98,61.76,52.98,50.51,33.06,24.55,20.87,20.73,20.67,20.58。

4.2 體外點擊速率的測定

化合物ADIBO-MAMA與化合物N3-DG-1～4體外點擊反應的各級動力學速率常數列于表1。

表1 ADIBO-MAMA與N3-DG-1～4體外點擊 反應的各級動力學速率常數Table 1 Kinetic study of the click reaction between ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

由表1可知，疊氮基團與糖環相隔一定距離(N3-DG-2～4)與其直接連在糖環上(N3-DG-1)相比，點擊速率大幅提升，可能的原因是糖環的位阻效應阻礙了三唑的形成。然而，一旦疊氮基團伸出糖環，隨著其與糖環距離的進一步延長，反應速率并未有顯著改變。

從表1結果可見，N3-DG-2更有希望成為合適的葡萄糖探針分子。最終挑選N3-DG-1作為對照組和N3-DG-2進行動物實驗。

4.3 標記物的制備及性質測定

通過對標記體系中pH、SnCl2用量、反應溫度、中間絡合劑等條件進行優化后，所得99Tcm-ADIBO-MAMA的標記率大于95%，如圖2所示。常溫下，標記物在空氣中放置8 h后放化純度大于95%，具有較好的體外穩定性。99Tcm-ADIBO-MAMA標記物LogP(O/W)=0.98±0.01，顯示為脂溶性。

4.4 體內分布實驗

99Tcm-ADIBO-MAMA(空白對照)及其與N3-DG-1，N3-DG-2體內點擊產物在荷S180腫瘤小鼠體內的生物分布結果列于表2～表4。

圖的Radio-HPLC分析圖Fig.2 Radio-HPLC (a), 99Tcm-GH (b), 99mTc-ADIBO-MAMA (c)

表2 99Tcm-ADIBO-MAMA在荷瘤小鼠體內的放射性攝取率(n=5)Table 2 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA in tumor-bearing mice (n=5)

續表2

表3 99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1體內點擊后在荷瘤小鼠體內的分布結果(n=5)Table 3 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-1 in tumor-bearing mice (n=5)

表4 99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊后在荷瘤小鼠體內的分布結果(n=5)Table 4 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-2 in tumor-bearing mice (n=5)

從表2～表4可以看出，99Tcm-ADIBO-MAMA、99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1，N3-DG-2體內點擊產物的肝攝取較高；這與化合物呈脂溶性相關。心、肺、胃和肌肉在開始有少量攝取，但很快清除。腦中則幾乎無攝取。

另外，從腫瘤/血液比值數據(表5)可以看出，在時間點為1 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1，N3-DG-2體內點擊產物的瘤血比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有較大提高，存在顯著性差異；在時間點為2 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊產物的瘤血比與99Tcm-ADIBO-MAMA的類似，沒有顯著性差異；在4 h和8 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊產物的瘤血比大于99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1體內點擊產物，有顯著性差異。相比于N3-DG-1(對照組)，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊更易發生，具有更好的腫瘤攝取和滯留。該結果與體外點擊反應速率快慢(表1)一致。

表5 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其與N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 體內點擊產物在荷S180腫瘤小鼠體內的瘤血比(n=5) Table 5 Comparison of tumor/blood ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

從腫瘤/肌肉比值數據(表6)來看，在各個時間點，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊產物的瘤肉比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有較大的提高，存在顯著性差異；同樣，相比于N3-DG-1(對照組)，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內點擊產物的瘤肉比提高的幅度更為明顯，存在顯著性差異，在時間點8 h時，瘤肉比高達10.27±3.30。該結果與體外點擊反應速率快慢(表1)也一致。因此，N3-DG-2比N3-DG-1的體內分布效果好，更具有作為葡萄糖代謝顯像劑的潛力。

表6 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其與N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 體內點擊產物在荷S180腫瘤小鼠體內的瘤肉比(n=5)Table 6 Comparison of tumor/muscle ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

5 結論

合成了MAMA偶聯的二苯并環辛炔配體和四種2-位含有疊氮基的小分子葡萄糖基團，體外反應速率測定實驗選定了兩種葡萄糖衍生物N3-DG-1(速率最慢，作為對照組)和N3-DG-2(速率最快)；接下來采用配體交換的方法完成了ADIBO-MAMA的99Tcm標記，標記條件優化后，標記率在95%以上。基于體內點擊化學，首先完成N3-DG-1和N3-DG-2在體內的預著靶，再注射99Tcm-ADIBO-MAMA進行尋靶，發生體內點擊反應，以99Tcm-ADIBO-MAMA為空白對照，根據動物分布結果篩選出最合適的葡萄糖代謝顯像劑。從動物分布實驗來看，N3-DG-1和N3-DG-2相比，后者的瘤血比和瘤肉比也要優于前者，但N3-DG-2預著靶策略對瘤肉比的改善較為明顯，對瘤血比的改善效果不佳，所以，還有待尋找其他的小分子葡萄糖基團以及對二苯并環辛炔改性(提高其水溶性)來進一步提高瘤血比。