64Cu-NOTA-NOC的制備及體內生物分布初步研究

趙海龍，李澤全，羅田偉，黃旭虎，王 寧，陳孟毅， 許 林，史旭東，鄧雪松，李洪玉

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國醫學科學院 醫學實驗動物研究所，北京 100021)

神經內分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasms, NENs)是一類起源于干細胞且具有神經內分泌標記物、能夠產生生物活性胺和(或)多肽激素的腫瘤[1-2]。在神經內分泌腫瘤(胃腸胰神經內分泌腫瘤、垂體瘤和嗜鉻細胞瘤等)和一些神經系統腫瘤(神經母細胞瘤和腦膜瘤等)的細胞上常有生長抑素受體(somatostatin receptor, SSTR)的過度表達[3-5]。生長抑素(somatostatin, SST)類似物能夠特異性地靶向SSTR過度表達的腫瘤細胞[6]，這一特性可被用于腫瘤的診斷和治療，放射性藥物的研究主要集中在SST八肽類似物(以下簡稱八肽)方面。近年來，FDA先后批準四種基于SST八肽的放射性藥物(68Ga-DOTATATE、177Lu-DOTATATE、68Ga-DOTATOC及64Cu-DOTATATE)，用于神經內分泌腫瘤的診斷和治療[4,7]。NOC也是一種SST八肽，2017年，Esposito等[8]對64Cu-DOTA-NOC進行了PET/CT顯像研究，結果顯示其可以準確檢測出胰島素瘤患者的病灶部位。

64Cu為新型醫用正電子核素，半衰期為12.7 h，通過電子俘獲、β-和β+方式衰變[4,9]。64Cu發射低能正電子，端點能量為0.653 MeV，與18F的最大正電子能量(0.634 MeV)相近；由于PET掃描圖像的分辨率取決于核素的正電子能量，以及由此導致的組織穿透范圍(直到電子湮滅)，因此64Cu所得PET圖像的分辨率幾乎可與18F的圖像相媲美[10-11]。因64Cu具有良好的核物理性質、優良的化學配位能力以及可通過回旋加速器獲得高比活度產品的特點，物理半衰期較長使其在臨床PET顯像的應用方面獨具優勢，近年來，已逐漸成為放射性藥物領域的研究熱點之一。隨著64Cu-DOTATATE的新近獲批[7]，64Cu標記藥物必將受到越來越多的關注。目前，對64Cu-八肽的研究主要集中于DOTATATE[3,12]，其標記反應條件較為劇烈，需95 ℃、反應15 min且需要對產物進行純化。據文獻報道[13]，64Cu與螯合基團NOTA能夠在溫和的條件下進行反應，但64Cu對NOTA-NOC的標記尚未見文獻報道。

本文利用正電子核素64Cu對NOTA-NOC進行放射性標記，對64Cu-NOTA-NOC的制備、質控分析、穩定性研究及生物學評價進行初步研究，為開發64Cu標記的SST類似物藥物用于SSTR陽性腫瘤診斷和治療提供參考。

1 實驗儀器及材料

1.1 主要儀器

CRC-55TW活度計：美國Capintec公司；2470全自動伽馬計數器：美國Perkin Elmer公司；MiliQ-Reference超純水機：密理博(中國)有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：Iertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，日本島津公司；Bioscan色譜儀伽馬計數器：德國Eckertk Ziegler公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多；VORTEX3螺旋振蕩器：德國IKA公司；干式恒溫金屬浴：上海凈信實業發展有限公司；雷磁PHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Inveon MM PET/CT：西門子。

1.2 主要試劑

NOTA-NOC：純度>95%，ABX公司；64CuCl2溶液：64Cu放射性核純度>99.9%，0.01 mol/L HCl溶液，pH 2.0～2.2，原子高科股份有限公司；乙酸(Metals basis)、乙酸鈉(Metals basis)：Alfa Aesar公司；乙腈：色譜純，德國Merck。

1.3 實驗動物

正常昆明(KM)小鼠，6～8周，18～22 g，SPF級，雄性，15只，北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號SCXK(京)2019-0008；荷BON-1胰腺癌裸鼠，10～12周，18～23 g，腫瘤大小0.5～1 cm3，雄性，18只，大江康泰(北京)生物科技有限公司，實驗動物許可證號SYXK(京)2017-0023。

2 實驗方法

2.1 64Cu-NOTA-NOC制備

取NOTA-NOC(結構示于圖1)多肽，使用乙酸/乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成0.68 g/L(摩爾濃度為0.5 mmol/L)溶液。取48 μL(24 μmol)NOTA-NOC溶液置于EP管內，加入20 μL64CuCl2溶液(3.7～7.4 MBq/μL)，渦旋混勻后(反應液pH為4.5～4.7)，將EP管放置于干式加熱器的加熱孔內，在25 ℃條件下孵育(500 轉/min)；15 min后，取出EP管；反應液用乙酸/醋酸鈉溶液(pH=4.8)稀釋至所需濃度，經0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。

圖1 NOTA-NOC的結構Fig.1 The structure of NOTA-NOC

2.2 64Cu-NOTA-NOC的質控分析

HPLC分析采用Shimadzu LC-20AT system高效液相儀，ODS-SP C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A：0.1%TFA/水；流動相B：0.1%TFA/乙腈。洗脫梯度：0～10 min,20%～80%流動相B；10～13 min,80%～80%流動相B；13～15 min,80%～20%流動相B，測定放化純度，觀察放射性峰的保留時間。

2.3 體外穩定性

2.3.1PBS緩沖體系中的穩定性 將64Cu-NOTA-NOC(18～28 MBq)經PBS(pH=7.4，0.2 mL)緩沖溶液稀釋后，37 ℃溫育，分別于2、12、24 h取反應液，采用HPLC測定其放化純度。

2.3.2胎牛血清中的穩定性 取64Cu-NOTA-NOC(30 μL，18～36 MBq)加入到10%胎牛血清溶液(0.5 mL)中，在37 ℃溫育，分別于2、12、24 h取反應液，加入乙腈(100 μL)，渦旋混勻，離心，取上清液，采用HPLC測定其放化純度。

2.4 脂水分配系數

將相同體積的正辛醇和磷酸緩沖溶液(pH=7.4)(0.5 mL：0.5 mL)加入到1.5 mL EP管中，再將64Cu-NOTA-NOC(約3.7 MBq,3 μL)溶于上述溶液中。蓋好后充分震蕩5 min，在離心機中離心分層5 min，轉速為2 000 r/min。分別取有機相和水相各100 μL于放免管中，在井型γ探測器中分別測量其放射性計數，采用logP=log(γ正辛醇/γ緩沖液)計算脂水分配系數，重復操作3次，取平均值為該標記物的脂水分配系數。

2.5 正常KM小鼠的生物分布

正常KM小鼠(雄性，18～22 g)15只，實驗前未禁食，隨機分為3組，每只尾靜脈注射10 μCi/0.1 mL(多肽的量約為4×10-11mol)的64Cu-NOTA-NOC，在注射后1、4、24 h斷頸處死、同時取血，取不同臟器稱重并測量放射性計數，計算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.6 荷瘤動物的生物分布

荷BON-1胰腺癌的裸鼠(雄性，18～22 g)16只，實驗前未禁食，隨機分為4組，每只尾靜脈注射10 μCi/0.1 mL(多肽的量約為4×10-11mol)的64Cu-NOTA-NOC，在注射后1、2、4、24 h斷頸處死、同時取血，取不同臟器稱重并測量放射性計數，計算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.7 動物PET/CT顯像

荷BON-1胰腺癌裸鼠分兩組，實驗前未禁食，分別經尾靜脈注射64Cu-NOTA-NOC(400-425 μCi/0.1 mL，約1.6×10-9mol)、64Cu-NOTA-NOC+阻斷劑(blocker，DOTATATE,150 μg)，采用混合氣體麻醉法對裸鼠麻醉，分別在給藥后的1、4和8 h進行PET/CT顯像，圖像采集時間為15 min。掃描結束后，使用filtered back projection(FBP)算法對圖像進行重建，使用西門子的Inveon Research Workplace 2.0工作站對腫瘤和主要器官進行定量分析。

3 結果與討論

3.1 標記與質控

64Cu-NOTA-NOC及NOTA-NOC的液相圖示于圖2。64Cu-NOTA-NOC的標記率在室溫反應15 min時即可高于95%。標記物64Cu-NOTA-NOC為無色透明溶液，64Cu2+的保留時間為3.11 min，目標化合物64Cu-NOTA-NOC的保留時間為10.40 min(其前體化合物NOTA-NOC保留時間為9.98 min)，放化純度大于95%，可不經純化直接用于下一步相關研究。

圖2 NOTA-NOC的HPLC分析圖(a)及64Cu-NOTA-NOC的Radio-HPLC分析圖(b)Fig.2 HPLC chromatography of NOTA-NOC (a) and Radio-HPLC chromatography of 64Cu-NOTA-NOC (b)

3.2 體外穩定性

64Cu-NOTA-NOC在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中的穩定性結果示于圖3。37 ℃下，在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中孵育24 h，放化純度均大于95%，均未見有明顯的游離64Cu2+出現，說明其在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中具有較好的穩定性。

圖3 64Cu-NOTA-NOC在PBS緩沖溶液 和10%胎牛血清中的穩定性結果Fig.3 Radiochemistry purity of 64Cu-NOTA-NOC in two systems

3.3 脂水分配系數

對64Cu-NOTA-NOC的脂水分配系數進行測定，根據所測得的數據計算得64Cu-NOTA-NOC的脂水分配系數為-1.12±0.005 6(n=3)，表明該配合物具有親水性。

3.4 正常KM小鼠生物分布

64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內的生物分布結果列于表1。由表1可知，64Cu-NOTA-NOC在腎臟中攝取較高，表明該配合物主要經腎臟代謝。同時在胃、胰腺中也具有較高的攝取，這可能與這些組織和器官內SSTR2受體表達水平較高有關。1 h時64Cu-NOTA-NOC在腎、胃及胰腺的放射性攝取率為(11.53±0.94) %ID/g、(10.52±1.31) %ID/g和(7.44±1.30) %ID/g。此外，通過表1可以看出64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內的代謝較快，相比于1 h時相，4 h時，除大腸外其他器官放射性攝取率均明顯下降。

表1 64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠中的 生物分布Table 1 Biodistribution of 64Cu-NOTA-NOC in normal KM mice n=5)

2018年楊志課題組[3]報道了64Cu-DOTATATE的研究結果，結果顯示64Cu-DOTATATE在Balb/c小鼠體內腎臟、肝臟攝取較高，并隨著時間延長而降低，說明其主要經腎臟、肝臟代謝，同時在胃、小腸、大腸中也具有較高的放射性攝取。本研究中64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內的代謝行為與64Cu-DOTATATE相類似。

3.5 荷瘤動物的生物分布

64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠體內的生物分布結果列于表2，由表2可知，64Cu-NOTA-NOC在血液中清除較快，1 h時(1.87±0.23)%ID/g ，2 h時(0.89±0.13)%ID/g。64Cu-NOTA-NOC在腎臟中的放射性攝取較高，1、2、4 h的放射性攝取率分別為(22.16±3.65)%ID/g、(16.93±0.81)%ID/g、(3.92±0.48)%ID/g，表明該化合物主要經腎臟代謝，與正常KM小鼠體內的代謝相一致。在胃、胰腺等器官和組織中也具有較高的放射性攝取，1 h時64Cu-NOTA-NOC在胃、胰腺的放射射性攝取率為(19.93±6.13)%ID/g和(10.09±2.11)%ID/g。

從表2可以看出，1、4 h時，荷瘤鼠肺部對64Cu-NOTA-NOC的放射性攝取率分別為(9.37±2.69)%ID/g、(3.76±0.41)%ID/g，而在正常KM小鼠體內，1、4 h時，64Cu-NOTA-NOC在肺部的放射性攝取率分別為(14.27±2.59)%ID/g和(9.05±1.68)%ID/g(見表1)。荷瘤鼠肺部和正常KM小鼠肺部對64Cu-NOTA-NOC的放射性攝取表現出較大的差異性，這可能與小鼠的種屬差異有關。除肺部外，64Cu-NOTA-NOC在荷瘤鼠體內的分布和代謝特點基本與正常KM小鼠相一致。64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中也表現出較高的放射性攝取率，1、2 h分別為(3.74±1.23)%ID/g和(4.80±0.92)%ID/g；注射后4 h，64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中的放射性攝取率下降，但腫瘤/血和腫瘤/肌肉的攝取比仍較高。在1、2、4及24 h四個時間點中，腫瘤/血和腫瘤/肌肉的攝取比在2 h時最高，分別為5.36和10.38。該研究中靶與非靶的攝取比高于楊志課題組[3]報道的64Cu-DOTATATE在荷PANC-1胰腺癌裸鼠中靶與非靶的比(1、10 h的腫瘤/血攝取比分別為(0.80±0.05)、(1.30±0.09)，1、10 h的腫瘤/肌肉攝取比分別為(1.23±0.11)、(1.89±0.09)。

表2 64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠中的生物分布Table 2 Biodistribution of 64Cu-NOTA-NOC in nude mice bearing BON-1 tumor n=4)

3.6 動物PET/CT顯像

64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠體內的PET/CT顯像結果示于圖4。給藥后1 h，64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中出現放射性濃聚，而加入阻斷劑后，腫瘤攝取明顯降低，提示腫瘤對64Cu-NOTA-NOC的攝取具有特異性。對64Cu-NOTA-NOC及64Cu-NOTA-NOC+Block的顯像結果進行定量計算(見表3)，結果顯示，64Cu-NOTA-NOC在小鼠體內代謝較快；1 h時64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中攝取率最高，為7.7%ID/g，而64Cu-NOTA-NOC+Block在1 h時腫瘤攝取率為0.94%ID/g，提示64Cu-NOTA-NOC能夠特異性的靶向腫瘤部位。與此同時64Cu-NOTA-NOC在膀胱、膽囊及胃中的攝取均較高，其中膀胱、膽囊在1 h時，攝取率最高，分別為28.1%ID/g和7.2%ID/g。

圖4 荷BON-1胰腺癌裸鼠注射 64Cu-NOTA-NOC(a)與64Cu-NOTA-NOC+ Blocker(b)后1 h的PET/CT顯像結果Fig.4 PET/CT images of nude mice bearing BON-1 tumor injected with 64Cu-NOTA -NOC (a) and 64Cu-NOTA-NOC (b) acquired at 1 h

表3 64Cu-NOTA-NOC及阻斷實驗中荷BON-1胰腺癌裸鼠的各個器官攝取率Table 3 Organ uptakes of 64Cu-NOTA-NOC in nude mice bearing BON-1 tumor with or without co-injection of blocker DOTATATE (150 μg) at 1 h, 4 h, 8 h

4 小結

本文對64Cu-NOTA-NOC的制備、質控分析、體外穩定性及生物學分布進行了初步研究。64Cu對NOTA-NOC的標記能夠在溫和的反應條件下高標記率的完成，在室溫條件下，反應15 min即可實現95%以上的標記率。64Cu-NOTA-NOC在緩沖溶液及10%胎牛血清中37℃孵育24 h，放化純度均大于95%，表明具有較好的體外穩定性；動物體內主要經腎臟代謝，符合八肽類化合物在生物體內的代謝行為。64Cu-NOTA-NOC在動物體內清除較快，在胰腺癌腫瘤組織中有較高攝取，能夠獲得清晰的PET/CT圖像，腫瘤/血和腫瘤/肌肉放射性攝取比于注后1、2和4 h均較高。初步的研究結果表明，64Cu-NOTA-NOC具有較好的體內外性質，具有用于胰腺癌診斷的潛質，后期將針對動物模型、給藥量等因素開展進一步研究。