氟[18F]比他班自動化合成及初步臨床應用

付華平，張曉軍，常 燕，王 媛，張錦明

(中國人民解放軍總醫院第一醫學中心 核醫學科，北京 100853)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)是進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性疾病[1]。據預測，到本世紀中葉，世界AD患者將增加至1.315億[2]，而國際老年癡呆協會中國委員會數據顯示，我國65歲以上老年人癡呆患病率為6.6%，且患病率每5年約增長一倍以上，80歲以上超過22%，到2050年，老年人口將增加到4億，癡呆患者將接近2 000萬，中國的癡呆人數將以336%的比例增長[3]。β淀粉樣蛋白是AD特征性的病理改變之一，能夠在AD早期反應疾病的發展。采用特異性結合Aβ的探針，PET顯像可見AD患者腦內Aβ蛋白分布，借助計算機軟件和生理數學模型進行定量分析，可以提高AD的早期診斷率。碳[11C]-PIB是一種較理想的Aβ顯像劑，由于其親脂性高，在腦內清除快，特異性強[4]，被稱為評價AD的“金標準”，但由于11C的半衰期只有20 min，只適用于擁有醫用回旋加速器的單位在線合成使用，每次合成僅夠1～2例患者使用。目前，國內僅有幾家醫院具備生產和使用11C-PIB的條件，限制了其臨床應用。18F-florbetaben用于疑似AD患者腦β-淀粉樣蛋白的視覺檢測，其靈敏度大于90%、特異性大于80%[5]，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)于2013年批準該顯像劑上市，美國FDA也于2014年批準Piramal Imaging公司氟[18F]比他班(商品名Neuraceq)上市，但是，針對該顯像劑的進口生產模塊功能單一、價格昂貴，目前國內尚未有醫院采購該模塊用于臨床藥物生產。本研究使用改良后的國產氟多功能合成模塊自動化合成氟[18F]比他班(18F-florbetaben)，進行相應的質量控制，并初步進行18F-florbetaben的臨床PET應用研究。

1 實驗材料

1.1 試劑

氧[18O]水(H18O豐度大于97%)：江蘇華益科技有限公司；合成試劑盒1、合成試劑盒2、純化試劑盒(試劑盒清單見表1)：德國ABX公司。

表1 18F-florbetaben試劑盒清單Table 1 Reagents list of 18F-florbetaben

1.2 儀器

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊：派特(北京)科技有限公司； 515 HPLC PUMP：美國Agilent公司；uMI 510 PET/CT掃描儀：上海聯影公司；SLGV233RS無菌液體濾膜：美國Millpores公司；BQSV-A.B.P.T濾膜壓力完整性測試儀：中國臺灣BQSV公司；InSpector Radiation ALERT表面沾污儀：美國S.E.公司；CRC-15R，CRC-25R活度計：美國Capintec公司。

1.3 實驗動物

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周齡，(20±5) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015.0001。

1.4 認知功能正常健康受試者及臨床患者

該研究通過本院倫理委員會批準(S2018-166-01)。認知功能正常健康受試者均為通過臨床查體和認知健康評估人員：女性兩例(63和64歲)；阿爾茲海默病患者選自中國人民解放軍總醫院第一醫學中心神經內科門診患者，參照Petersen等診斷標準：男性一例(76歲)，女性一例(75歲)；認知功能正常健康受試者或患者家屬均簽署知情同意書。

2 實驗方法

2.1 18F-florbetaben自動化制備

加速器經18O(p,n)18F反應得到18F-，由N2載帶至QMA捕獲，用0.6 mL洗脫液(含22 mg K2.2.2、7 mg K2CO3、0.3 mL乙腈、0.3 mL水)將QMA柱上18F-洗脫至反應瓶中，通入N2氣流100 mL/min，115 ℃加熱干燥4.5 min，再降低溫度至85 ℃加熱2 min保證除水完全；加入前體(7.0 mg叔丁氧羰-甲磺酸酯-二苯乙烯溶于1.8 mL乙腈)，120 ℃反應10 min；冷卻后加入1.7 mL 2 mol/L鹽酸，在110 ℃下水解5 min；加入5 mL中和溶液(含1.2 mL 2 mol/L NaOH、0.8 mL 1.0 mol/L甲酸銨、0.5 mL水、0.5 mL乙醇、2 mL乙腈)；混勻后利用HPLC分離，流動相為500 mL 60%乙醇水溶液(含0.16 g抗壞血酸、1.02 g抗壞血酸鈉)，流速6 mL/min)，收集tR=7 min處產品峰，通過無菌濾膜至產品瓶(收集60 s，共計6 mL)，再將23 mL稀釋基底液(含聚乙二醇400 5.2 mL、抗壞血酸0.15 g、抗壞血酸鈉0.98 g、無水乙醇0.75 mL)通過無菌濾膜洗入產品瓶，共29 mL。合成路線示于圖1。

圖1 18F-florbetaben合成路線示意圖Fig.1 Synthesis of 18F-florbetaben

2.2 18F-florbetaben的質量控制

目檢18F-florbetaben注射液的性狀：顏色及澄清度；使用精密pH試紙測量酸堿度；使用活度計檢測產品的放射性活度；用半對數作圖法估計半衰期；使用碘鉑酸硅膠G薄層板檢測產品中K2.2.2含量；使用分析型HPLC測量化學純度和放化純度[色譜柱為Atlantis T3，150 mm×4.6 mm，5 μm: Waters，紫外波長為320 nm，流動相A為磷酸鹽緩沖溶液(含磷酸二氫鉀680.5 mg、水1 050 mL和85%的磷酸溶液0.85 mL)，B為乙腈；流速為1.5 mL/min，線性梯度洗脫：0～5.5 min B/A為40/60(v/v)；5.5～5.6 min B/A為90/10(v/v)；5.6～10 min B/A為60/40(v/v)；氣相色譜分析有機溶劑乙腈殘留；凝膠法檢測細菌內毒素；起泡點測試儀檢測無菌濾膜的完整性。

2.3 小鼠毒性實驗

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.1 mL 20 mCi/mL的18F-florbetaben注射液，正常飼養，48 h觀察是否正常。

2.4 臨床PET/CT顯像

受試者按體質量靜脈注射4.44 MBq/kg11C-PIB注射液并進行PET/CT顯像；3 d后接受18F-florbetaben注射液，安靜環境下休息90 min后行頭部CT掃描，然后行PET圖像采集，動態掃描20 min。CT重建采用標準重建法，利用CT數據對PET圖像進行衰減校正；CT重建采用標準重建法，掃描參數：電壓120 kV，電流100 mA，層厚5 mm；PET圖像重建采用OSEM法，采用3D模式連續動態采集20 min，矩陣336×336，軸向視野為21.6 cm，以ROI技術勾畫病變區域并計算SUVR。

3 結果與討論

3.1 18F-florbetaben注射液的自動化制備

國產氟多功能模塊置于符合GMP環境要求的熱室內，18F-florbetaben注射液利用該模塊自動化合成。整個合成包括除水、氟化親核取代、脫保護基和半制備HPLC純化，合成耗時約為38 min，不校正合成效率為(45.0±2.3)%(n=6)，合成穩定性和可靠性高。目前已合成30次，成功率100%，隨機三批藥物合成參數列于表2，分析型HPLC結果示于圖2。

表2 三批次藥物合成參數Table 2 Synthesis parameters of three batches of the drug

有不同工藝可用于合成18F-florbetaben：前體可為無保護基團的Stilbene-PEG-OMs或含保護基團的Boc-Stilbene-PEG-Oms，純化方法可以采用半制備HPLC或Sep-pek C18小柱，有文獻比較了不同前體和不同純化方法生產18F-florbetaben的異同，結果顯示以無保護基化合物為前體、使用C18柱純化在時間和產率上均占優勢，但C18小柱純化無法實現前體的分離，產品中K2.2.2去除也不完全(雖然能通過半定量檢測)[6]。本研究采用含有保護基團的前體Boc-Stilbene-PEG-Oms，半制備HPLC純化，制備工藝嚴格按照美國FDA批準的18F-florbetaben制備工藝進行，該工藝使用一步除水，流動相流速為6 mL/min，在合成時間和效率方面都有明顯優勢。

3.2 18F-florbetaben注射液的質量控制

在鉛玻璃下，產品為無色或淡黃色透明溶液，半衰期在105～115 min之間，γ能譜鑒定核素為18F，pH約為5.5；樣品放射性峰與標準品紫外吸收峰相對保留時間一致，18F-florbetaben放化純度大于95%，18F-florbetaben順式異構體含量小于6%，其他化學雜質總含量小于10%；K2.2.2含量低于50 μg/mL；乙腈殘留低于0.41 mg/mL，乙醇含量為12.4%；濾膜氣泡點大于1.5 bar；細菌內毒素低于15 Eu/mL。使用當前18F-florbetaben合成工藝，有三個產品質控關鍵點：① 高活度下產品輻射分解；② 順式異構體的放射化學含量；③ 含抗壞血酸(Vc)條件下K2.2.2測量。為了防止產品在高活度下輻射分解，除HPLC分離流動相內加入穩定劑抗壞血酸/抗壞血酸鈉外，產品稀釋基底液中也加入了抗壞血酸/抗壞血酸鈉；18F-florbetaben在光照下會產生順式異構體，為了減少其異構體的出現，自動化合成模塊增加了光源控制按鈕，在18F-傳輸完畢，關閉模塊光源，同時將熱室的光源關閉，產品合成過程為全自動，此時控制計算機軟件即可完成產品合成與收集，最大程度減少了18F-florbetaben順式異構體的出現；為了防止抗壞血酸對K2.2.2測量的干擾，對照品溶液均使用基質溶液(含107.2 mg抗壞血酸、701.6 mg抗壞血酸鈉、16 mL水、4.4 mL聚乙二醇400和3.6 mL無水乙醇)配制。

a——18F-florbetaben的保留時間為4.228 min； b——標準品19F-florbetaben的保留時間為3.969 min 圖2 分析型HPLC譜圖Fig.2 HPLC spectrum of 18F-florbetaben

3.3 毒性實驗

小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應。

3.4 臨床初步應用

臨床PET/CT圖像(圖3)顯示，認知功能正常志愿者18F-florbetaben和11C-PIB顯像大腦形態如常，皮層各葉放射性分布未見明確濃聚，皮層下各神經核團顯影清晰，放射性分布對稱；而AD患者全腦18F-florbetaben SUVR為1.70，放射性分布增高、滯留，與11C-PIB基本一致。Senda等臨床藥理學研究結果顯示，18F-florbetaben腦攝取迅速，從血中清除快，注射4 h后，血液中幾乎檢測不到放射性[7]。放射自顯影法并經免疫組化染色等技術證實18F-florbetaben與AD患者大腦的β淀粉樣蛋白斑塊沉淀具有很高的結合力[8]，而且18F-florbetaben不與腦組織的tau蛋白或α-突觸核蛋白結合，顯示了它在診斷AD方面具有高的特異性[9]。有研究結果顯示18F-florbetaben與AD顯像劑“金標準”的11C-PIB的全腦SUVRs呈高度一致[10-11]。

圖3 NC組和AD組PET/CT圖像Fig.3 PET/CT images for NC and AD groups

4 小結

18F-florbetaben可以作為阿爾茨海默病診斷的一種理想顯像劑。針對該藥物進口合成模塊的諸多局限，本研究提出使用改良的國產模塊自動化合成18F-florbetaben，具有合成時間短、生產效率高等優勢，可滿足藥物遠距離配送的應用需求，使無法生產該顯像劑的影像中心可以開展AD檢查，使患者受益。