利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)改良大粒香稻瘟病抗性

吳 嫻， 李佳麗， 曾慶鴻， 張大雙， 徐海峰， 姜 雪， 宋 莉， 彭 強(qiáng)， 朱速松

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗室， 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所， 貴陽 550006； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心， 貴陽 550001)

水稻(OryzasativaL.)是世界上最主要的糧食作物之一[1]。但其產(chǎn)量每年都會受制于稻瘟病的暴發(fā)，嚴(yán)重時整穗枯死，造成絕收[2]。因此，提高稻瘟病抗性，對提高水稻產(chǎn)量有重要意義。稻瘟病是由稻瘟病原菌(Magnaportheoryzae)侵染引起的病害，在水稻整個生育期都可發(fā)生。目前，除了第3號染色體沒有發(fā)現(xiàn)抗性基因之外，其余染色體上都有抗性基因分布，現(xiàn)已有二十多個稻瘟病抗性基因得到克隆且進(jìn)行功能驗證[3]。Pid3基因是Shang等[4]通過設(shè)計特異于日本晴NBS-LRR假基因等位基因的PCR分子標(biāo)記，比較秈稻和粳稻假基因化差異，從秈稻品種地谷中鑒定出來的一個主效稻瘟病抗性基因。Chen等[5]從秈稻品種谷梅2號中利用圖位克隆方法分離出一個新的稻瘟病抗性等位基因Pi25，分析表明與Pid3蛋白的基因序列完全一致。Pid3位于第6號染色體上，其cDNA全長為2 970 bp，包含兩個外顯子，編碼923個氨基酸，含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域和MHD基序的蛋白產(chǎn)物[6]。

近年來，CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)發(fā)展較為迅速，該系統(tǒng)已逐漸發(fā)展為遺傳育種中改良作物的有效手段，可針對某些存在不良性狀的優(yōu)質(zhì)稻材料進(jìn)行基因位點(diǎn)編輯，從而獲得兼并優(yōu)良品質(zhì)與性狀的新品種。Xu等[7]利用CRISPR/Cas 9敲除了有關(guān)水稻千粒重的基因GW2、GW5及TGW6，發(fā)現(xiàn)突變體粒重、粒長和粒寬均顯著增加。郭洪剛等[8]定點(diǎn)編輯水稻株高基因OsGA20ox2，突變體植株株高降低了29.6%。蔡夢穎等[9]靶向編輯了水稻中SSSIIb基因，降低了SSS 2-Q家系直鏈淀粉含量，其品質(zhì)得到改善。周文甲等[10]對綏粳14的香味基因Badh2進(jìn)行編輯，其突變體香味物質(zhì)含量是原來的近兩倍，成功對野生型材料進(jìn)行了香味改良。

大粒香是貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所采用粳秈雜交方法育成的香稻品系[11]，其稻米品質(zhì)優(yōu)異，粒形大，色澤晶瑩透亮，粒粒醇香，農(nóng)業(yè)部檢測中心檢測為一級稻米，自2003年以來連續(xù)5次榮獲中國十大金獎大米[12]，但受其稻瘟病抗性差的影響，限制了其大規(guī)模推廣應(yīng)用。因此，本研究利用CRISPR/Cas 9技術(shù)對大粒香中的目標(biāo)基因pid3進(jìn)行編輯，獲得具有稻瘟病抗性的大粒香改良品種，攻克優(yōu)質(zhì)稻大粒香不抗稻瘟病的生產(chǎn)應(yīng)用難題，為貴州省抗稻瘟病品種選育提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以稻瘟病感病品種大粒香為轉(zhuǎn)基因受體材料，由貴州省水稻研究所育成，大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株 DH 5 α、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA 105、試驗所用pYLgRNA-OsU 3、pYLgRNA-OsU 6 a及pYLCRISPR/Cas 9-MH雙元載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士提供。

1.2 gRNA 靶點(diǎn)接頭設(shè)計及載體構(gòu)建

通過MSU-RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)獲得pid3(LOC_Os 06 g 22460)的基因序列，利用CRISPRGE在線網(wǎng)站(http://skl.scau.edu.cn/)設(shè)計適用于水稻基因突變gRNA序列。利用NCBI 對水稻基因組進(jìn)行BLAST來分析確認(rèn)靶位點(diǎn)的特異性，排除潛在脫靶序列，靶點(diǎn)接頭引物為Pid 3-U 3-F/Pid 3-U 3-R，Pid 3-U 6 a-F/Pid 3-U 6 a-R。

載體構(gòu)建參照Ma等[13]的試驗方法進(jìn)行，將所連接好的產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選陽性菌落。

表1 本研究中使用的引物

1.3 T0代植株獲得與驗證

采用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，參考周文甲[14]的方法。將含有基因編輯系統(tǒng)的菌液轉(zhuǎn)化到大粒香愈傷組織中。采用質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的潮霉素進(jìn)行篩選，通過共培養(yǎng)、水洗、篩選、預(yù)分化、分化、生根等步驟獲得再生組培苗，之后移栽到土壤中，在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

采用CTAB法[15]抽提葉片組織DNA，設(shè)計載體引物SP-ML/SP-R進(jìn)行陽性鑒定。同時，分別在pid3靶序列兩側(cè)設(shè)計擴(kuò)增引物CR-d 3-F/CR-d 3-R來擴(kuò)增T0代陽性植株的目的條帶，觀察其編輯情況。其擴(kuò)增條件為：95 ℃變性45 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸70 s，32個循環(huán)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 無Csa 9位點(diǎn)純合編輯株系的篩選

將T0代突變的crispr-pid 3雙靶點(diǎn)材料進(jìn)行自交，篩選出具有突變但已經(jīng)不含Cas 9基因的穩(wěn)定性突變植株。利用載體引物SP-ML/SP-R擴(kuò)增T1代突變體基因組序列，擴(kuò)增不出條帶的為無轉(zhuǎn)基因成分的突變體植株。采用20 μL rTaqPCR體系，對crispr-pid 3雙靶點(diǎn)材料用CR-d 3-F/CR-d 3-R引物擴(kuò)增外源，送公司雙向測序。利用序列比對軟件Sequencher 4.9分析crispr-pid 3材料靶基因編輯情況。

1.5 突變體稻瘟病抗性鑒定

在稻瘟病抗性鑒定區(qū)試點(diǎn)種植T1代純合突變的crispr-pid3雙靶點(diǎn)材料，用大粒香作對照。參照水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程(NY/T 2646-2014)，對每個株系的每個單株進(jìn)行單株種植，對于苗葉瘟，每株調(diào)查發(fā)病最重的葉片，取發(fā)病最重的3株平均數(shù)作為評價的依據(jù)，而穗瘟在水稻黃熟初期，即80%小穗尖端谷粒成熟時，調(diào)查發(fā)病最重的稻穗，進(jìn)行田間病圃稻瘟病病情鑒定。即采用自然誘發(fā)法測定葉瘟和穗瘟，抗性綜合評價分級劃分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感(S)和高感(HS)共6個標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻pid3基因編輯載體的構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas 9靶點(diǎn)設(shè)計要求，在pid3第一外顯子上設(shè)計靶位點(diǎn)序列，其PAM序列為NGG。為了提高突變效率，設(shè)計兩個靶點(diǎn)(target 1：AAGAACCTTTCGTATCAAGG；target 2：GTCTGCCTAGATCCCAAGACGGG)(圖1 A)。將帶有兩個靶點(diǎn)的gRNA表達(dá)盒連接到pYLCRISPR/Cas 9-MH載體骨架上(圖1 B)，構(gòu)建好的載體為crispr-pid 3。

通過Overlaping PCR方法進(jìn)行的靶位點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒的連接，其對應(yīng)sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建片段U 3-sgRNA及U 6 a-sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為767 bp及629 bp，證明了構(gòu)建的不同載體的sgRNA表達(dá)盒都正確(圖2 A)。構(gòu)建好的Cas 9/sgRNA表達(dá)載體經(jīng)過電激轉(zhuǎn)化后挑取單克隆，將連有靶點(diǎn)的gRNA 表達(dá)盒膠回收產(chǎn)物采用邊切邊連法組裝到載體骨架上，比對所有靶點(diǎn)序列及啟動子序列，均為陽性克隆(圖2 B、C)。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

CRISPR/Cas 9編輯載體經(jīng)測序及酶切驗證無誤后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA 105菌株。侵染大粒香愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到潮霉素篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選(圖3 A)，選擇培養(yǎng)兩次，一次2周，將經(jīng)篩選得到的抗性愈傷轉(zhuǎn)到帶抗性的預(yù)分化培養(yǎng)基中，再轉(zhuǎn)移到三角瓶里的分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(圖3 B)，待苗長到3～4 cm時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖3 C)。最后獲得45株T0代植株，編號為A 1～A 45。

2.3 T0代轉(zhuǎn)基因植株檢測

利用載體引物SP-ML/SP-R檢測轉(zhuǎn)基因苗中T-DNA區(qū)，篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。結(jié)果表明，45株轉(zhuǎn)基因苗中有30株陽性苗(圖4 A、B)。利用引物CR-d 3-F/CR-d 3-R檢測crispr-pid 3雙靶點(diǎn)材料pid3基因靶位點(diǎn)編輯情況，發(fā)生大片段編輯事件的有19株(圖4 C、D)。其中發(fā)生大片段編輯的且為單一條帶的材料有3株，單株編號分別為A 42、A 43和A 45。

2.4 T1代不含Cas 9編輯位點(diǎn)的突變體篩選及靶位點(diǎn)檢測

將T0代基因突變植株(A 42、A 43、A 45)自交繁殖獲得T1代植株，利用載體引物篩選出9株無Cas 9編輯位點(diǎn)的植株(圖5 A)，再通過CR-d 3-F/CR-d 3-R進(jìn)行擴(kuò)增，對比材料靶基因編輯情況(圖5 B)。試驗共得到B 1～B 9共9株所需突變材料，9株材料通過靶位點(diǎn)引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序檢驗均為純合突變(表2)。9株T1代純合突變的crispr-pid 3雙靶點(diǎn)材料，靶基因發(fā)生大片段缺失，測序結(jié)果表明編號為B 7、B 8號缺失69 bp外，其余均缺失70 bp(B 1～B 6、B 9)，初步觀察田間表型(圖5 C)，可以觀察到稻瘟病有所改善。

表2 T1代基因靶位點(diǎn)檢測

2.5 純合突變株系的稻瘟病抗性鑒定

為了鑒定CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的純合突變株系對稻瘟病菌的抗性，以原種大粒香作為對照，種植9株T1代突變的crispr-pid 3雙靶點(diǎn)材料。針對葉瘟來說，對照大粒香表現(xiàn)為高感，葉枯死面積占葉面積的50.1%～75.0%，T1代中有6株(B 1～B 4、B 6、B 8)抗性類型表現(xiàn)為感，枯死面積占葉面積的25.1%～50.0%，其余3株(B 5、B 7、B 9)為害面積占葉面積的10.1%～25.0%。而對于穗瘟來說，雖然其發(fā)病率均>50%，表現(xiàn)為高感，但損失率下降了2～4個等級(B 2除外)，尤其是B 7和B 8，損失率顯著下降。綜合各項鑒定指標(biāo)，原種大粒香表現(xiàn)為高感(≥7.6)，其余編輯成功材料表現(xiàn)為感(6.1～7.5)。

表3 稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

2.6 米質(zhì)分析

為了考察本試驗在敲除pid3基因的同時是否影響大粒香的米質(zhì)，因此挑選T1代中CRISPR/Cas 9基因成功編輯的兩個材料，即具有代表性的突變體B 5(缺失70 bp)和B 7(缺失69 bp)進(jìn)行米質(zhì)分析。依據(jù)NY/T 593-2013的衡量標(biāo)準(zhǔn)，對改良株系B 5和B 7與對照組大粒香進(jìn)行稻米品質(zhì)鑒定。

綜合分析大粒香、改良株系B 5及B 7可知，改良株系其理化品質(zhì)如出糙率、精米率、整精米率、堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量、膠稠度、堿消值級、透明度、水分等性狀并未發(fā)生顯著改變，由萬深SC-G考種儀所測量的米粒長、寬及千粒重等性狀也無明顯改變。說明本試驗在編輯抗稻瘟病基因的同時并沒有影響其他基因的表達(dá)，改良株系的米質(zhì)并未因pid3基因的編輯而受到影響。

表4 米質(zhì)分析結(jié)果

3 討 論

稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，被稻瘟病侵染會造成不同程度的減產(chǎn)，有的地區(qū)甚至顆粒無收。稻瘟病的危害不僅表現(xiàn)在產(chǎn)量損失嚴(yán)重，也會嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)[16]。常規(guī)育種主要是依靠抗性表型來進(jìn)行選擇，但高度依賴水稻品種、致病小種等因素，選育效率不高，且耗時長[17]。而CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)育種相比，操作簡便，成本低等優(yōu)點(diǎn)。楊海河等[18]基于CRISPR/Cas 9技術(shù)對粳稻感病品種日本晴的pi21基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，提高了稻瘟病抗性水平。徐鵬等[19]利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建以Pita、pi21和ERF922為靶基因的共編輯載體，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳且具有較高稻瘟病抗性的純合突變株系。研究表明，利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)可改良水稻稻瘟病抗性，加快抗稻瘟病的水稻新品系培育。

在本研究中，利用CRISPR/Cas 9基因編輯系統(tǒng)，在獲得的45株轉(zhuǎn)基因苗中，有19株發(fā)生了大片段編輯，從中選擇3株材料(A 42、A 43和A 45)，自交獲得T1代，在T1代中篩選出9株無外源Cas 9位點(diǎn)的突變材料(B 1～B 9)，其突變類型具有兩大類，一類缺失69 bp，另一類缺失70 bp。對9株編輯材料進(jìn)行田間病圃稻瘟病病情鑒定，與原種大粒香相比，稻瘟病抗性均有一定程度提高。且通過對T1代米質(zhì)分析，突變株重要性狀與野生型大粒香相比并沒有顯著差異，說明編輯pid3基因時沒有導(dǎo)致其他品質(zhì)基因序列的改變。因此利用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)可以有效定向改良優(yōu)質(zhì)稻稻瘟病抗性。研究結(jié)果也為攻克優(yōu)質(zhì)稻大粒香不抗稻瘟病的生產(chǎn)應(yīng)用難題提供了一個范例。