基于SRAP標記的大蒜種質資源遺傳多樣性分析

李晉華, 冷家歸, 羅莉斯, 王少銘, 侯穎輝, 李德文

(1.貴州省農業科學院香料研究所, 貴陽 550006; 2.貴州省農業科學院油料研究所， 貴陽 550006)

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科蔥屬一年生草本植物，具有較高的藥用和食用價值，用途廣泛、加工產品種類多樣，深受人們的喜愛。我國是世界上最大的大蒜生產國和出口國，大蒜品種資源豐富，種植區域廣泛。近年來，培育出了很多符合不同需求的新品種，但是由于定向選育與淘汰在增加了大蒜品種的同時，也降低了遺傳多樣性。為了更有效地保護和利用大蒜種質資源，對大蒜的研究也越來越受重視[1-3]。

目前關于大蒜的研究主要集中在品種培育[4]、病蟲害防治[5-6]、生化成分[7]、遺傳多樣性[8-9]等方面。隨著分子生物學的發展，遺傳多樣性已經從形態標記、同工酶標記、細胞標記發展到分子標記技術。基于基因組水平的分子標記技術在大蒜遺傳多樣性研究中被廣泛應用，劉新雨等[10]從大蒜轉錄組序列中共鑒定出141 132個SSR位點，利用篩選到的6條SSR引物對35份供試材料進行擴增，多態性條帶為26條，在遺傳相似系數0.756 9處35份材料被分為五類。王海平等[11]用AFLP、SSR 和 InDel 三種標記分析212份大蒜種質資源的遺傳結構與遺傳背景，結果發現，三種標記的引物共獲得清晰可辯的位點502個，多態性位點 492 個，不同引物揭示的大蒜基因多樣性指數分布在 0.17～0.38之間。王丹丹等[12]采用正交實驗建立了大蒜近緣種的SRAP反應體系，為大蒜近緣種進一步研究提供技術支持。

相關序列擴增多態性(sequence related amplifiedpolymorphism,SRAP)是一種新型的基于 PCR 擴增的標記技術[14]。由于 SRAP 具有不需預知物種的序列信息、高效快速、多態性好、擴增穩定、重復性高等優點[15]，廣泛應用于種質資源的遺傳圖譜構建、品種鑒定[16]、遺傳多樣性與親緣關系等領域[17]。本研究以貴州省農業科學院香料研究所種植的96份大蒜種質資源為材料，通過SRAP分子標記技術探索其遺傳多樣性與群體的親緣關系，為大蒜種植資源的保護、利用及進一步研究提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試的96份大蒜種質資源種植于貴州省農業科學院香料研究所貴陽試驗地香料資源圃(北緯26°，東經106°，海拔1 127 m)，其中74份來自貴州省的9個市、自治州，其余22份分別來自重慶、云南、湖北等8個省、直轄市(表1)。主要試劑：dNTPs、10×TaqBuffer(Mg2+)、Taq酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DL 1500 DNA Marker購自中國高端生物試劑有限公司，瓊脂糖、30%聚丙烯酰胺、50×TAE Buffer等均購自索萊寶生物工程(北京)有限公司。主要儀器：NanoDropTMND-1000核酸蛋白測定儀(Thermo，美國)、C 1000 Touch PCR儀(BIO-RAD，美國)、DYCZ-30 C型雙板夾芯式垂直電泳儀和DYY-6 C型雙穩定時電泳儀電源(北京六一生物有限公司)。

表1 供試材料的基本信息

1.2 基因組DNA提取與檢測

選取大蒜嫩葉，采用改進的CTAB法提取基因組DNA，在提取液中加入2% 的 β-巰基乙醇以除去酚類物質。DNA濃度在微量核酸濃度測定儀上測定，然后通過用1%的瓊脂糖凝膠95 V電泳30 min檢測所提DNA的質量與完整性。

1.3 PCR電泳

SRAP引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，從 864 對引物組合中篩選出22對擴增清晰、重復性好的引物組合，采用降落PCR(touchdown PCR)進行擴增。SRAP-PCR擴增體系為10.0 μL：模板DNA 1.5 μL，dNTPs 0.2 μL，10×TaqBuffer(Mg2+)1 μL，Taq酶 0.2 μL，Me引物0.5 μL，Em引物 0.5 μL，ddH2O 補足至10.0 μL，每個PCR反應體系設2個重復。擴增程序為：94 ℃預變性6 min；94 ℃ 45 s，53～48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行10個循環，退火溫度每循環下降0.5 ℃；94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行30個循環；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。擴增產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，恒壓 300 V，電泳1 h，用銀染法顯色，然后拍照記錄。

1.4 數據統計與分析

電泳結束后進行人工讀帶，在相同的位置上清晰的條帶記為1，沒有的條帶記為0，建立0，1原始矩陣。統計擴增產物的總條帶數和多態性條帶數，其中，多態性條帶比率P(%)=(多態性條帶數/總條帶數)×100%。用Popgene 32軟件統計觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei基因多樣性指數(H)、Shannon’s多樣性信息指數(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內基因多樣性(Hs)、基因分化系數(Gst)、基因流(Nm)。根據Popgene 32軟件計算出的遺傳一致度利用NTSYS pc-2.1軟件按非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析，構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物擴增多態性分析

用篩選出的22對引物對供試材料進行PCR擴增(圖1～圖2)。從擴增結果(表2)可以看出，22對引物共擴出173條帶，平均每對引物擴出7.86條，其中多態性條帶161條，多態性條帶比率為93.66%，不同的引物擴出的總條帶數有差異，多態性條帶數介于5～10之間，平均每對引物檢測出的多態性位點為7.32條。擴增位點數最多的引物組合是Me 26-Em 18，擴出了10條帶；其次為Me 7-Em 13、Me 7-Em 17，擴出9條帶；擴增條帶最少的是Me 7-Em 22和Me 8-Em 20，都只擴出了5條帶。PIC在0.635 7～0.889 7之間，引物組合Me 7-Em 22的PIC最低，為0.635 7，Me 26-Em 18的PIC最高，為0.889 7。無論是擴增條帶的大小，還是擴增條帶的多少，不同的引物在同一個采樣點大蒜樣品的擴增結果存在差異，同一引物在不同材料之間的擴增結果也不同。這說明供試的大蒜種質資源間存在豐富的多態性。因此，利用SRAP分子標記可以從DNA水平檢測出大蒜種質資源間的差異。

表2 SRAP 引物擴增產物的多態性

2.2 大蒜種質資源親緣關系分析

用Popgene 32軟件對96份大蒜種質資源的遺傳多樣性參數進行分析，結果表明，遺傳一致度范圍為0.347 8～0.819 9，遺傳距離范圍為0.035 1～0.802 4，Na為2.000，Ne為1.800 0，H為0.434 8，平均I為0.623 3，大蒜雖為無性繁殖植物，但具有一定的遺傳多樣性。

利用NTSYS-pc 2.1軟件對 96份大蒜材料進行聚類分析，得到相應的UPGMA樹狀圖(圖3)，在遺傳相似系數為0.58時將96份供試材料分為五類，第Ⅰ類包含73份大蒜材料，第Ⅱ類包含8份大蒜材料，第Ⅲ類包含一份大蒜材料，第Ⅳ類包含8份大蒜材料，第Ⅴ類包含6份大蒜材料。

2.3 不同大蒜群體種質資源親緣關系分析

利用Popgene 32軟件對18個大蒜群體之間的遺傳距離和遺傳一致度進行計算(表3)，結果表明，遺傳一致度范圍為0.633 5～0.974 4，遺傳距離范圍為0.025 9～0.456 4。遺傳一致度最高的是畢節與凱里的供試大蒜材料，其遺傳距離為0.025 9，遺傳一致度最低的是江蘇與四川的供試材料，其遺傳距離值最大為0.456 4，說明其親緣關系最遠。

表3 供試材料的遺傳一致度與遺傳距離

對供試的18個大蒜群體進行遺傳多樣數參數分析，結果見表4。18個群體的Na在1.000 0～1.962 7之間，Ne在1.000 0～1.605 5之間，H介于0.144 1～0.355 7之間，I在0.210 3～0.529 7之間，N.P.B在56～155之間，PPB介于34.78%～96.27%之間。四川和江西這兩個地點都只有一份供試材料，因此Na和Ne都是1.000 0。H、I、N.P.B、PPB都是安順市的大蒜群體多樣性最低，說明該地大蒜的遺傳多樣性最低，遵義市大蒜群體的各個遺傳多樣性指數均為最高，說明其遺傳多樣性最高。

表4 18個供試大蒜群體的遺傳多樣性指數

96份供試大蒜種質資源總的遺傳多樣性指數如表5所示，群體總基因多樣性Ht為0.363 3，群體內基因多樣性Hs為0.232 3，Gst為0.360 4，Nm為0.887 4。整體來說，96份供試大蒜資源的多樣性較豐富，群體內的基因多樣性較高，群體間和群體內的基因交流較為頻繁，供試材料豐富的遺傳多樣性可以為種質資源的保護、利用和良種培育提供材料。

表5 96份供試材料的遺傳多樣性指數

2.4 UPGMA聚類分析

利用NTSYS-pc 2.1軟件對18個大蒜群體進行聚類分析，得到相應的UPGMA樹狀圖(圖4)，在遺傳相似系數為0.83時，將供試大蒜群體分為五類：第Ⅰ類包含貴州省的遵義、六盤水、凱里、畢節、貴陽、銅仁、黔西南、黔南、黔東南以及甘肅、山東、湖北、云南、重慶14個大蒜群體;第Ⅱ類為湖南大蒜群體；第Ⅲ類為貴州省安順市大蒜群體；第Ⅳ類為江蘇省大蒜群體；第Ⅴ類為四川省大蒜群體。

第一類在遺傳系數為0.88時被分成七個亞類。第一個亞類包含貴州省5個市大蒜材料和甘肅省的4份大蒜材料，說明甘肅省與貴州省5個市的大蒜材料遺傳背景相似，親緣關系較近；第二個亞類為山東的大蒜群體；第三個亞類為湖北的大蒜群體；第四個亞類為銅仁的大蒜群體；第五個亞類為云南的大蒜群體；第六個亞類為重慶的大蒜群體；第七個亞類為黔東南苗族侗族自治州的大蒜群體。可見，大蒜種質資源聚類結果主要由品種差異決定，受地域影響較小。

3 結論與討論

SRAP 分子標記具有其獨特的優點，已經被廣泛地應用于種質遺傳多樣性和親緣關系的分析研究。王少銘等[18]利用 SRAP 分子標記對48份薄荷種質資源進行了親緣關系和遺傳多樣性分析，結果表明，供試薄荷種質資源的遺傳相似系數范圍為0.67～0.97；張穎聰等[19]利用28 對 SRAP 引物，對 20 份番木瓜種質資源進行了遺傳多樣性分析。此外，SRAP 分子標記在香蕉[20]、菠蘿[21]、菠蘿蜜[22]等作物上都有相關應用。由此說明，SRAP 分子標記技術能較好地反映種質資源的遺傳變異，可用于開展大蒜種質資源遺傳多樣性分析。

本研究以收集的18個群體96份大蒜種質資源為材料，分析其遺傳多樣性。PCR反應中，引物的退火溫度直接影響擴增結果，因此在實驗中需要花費大量的時間來摸索最適的退火溫度，利用降落PCR進行擴增，設置溫度區間進行降溫擴增，在不需要摸索退火溫度的前提下就可以到達最好的擴增效果。從擴增結果來看，22對引物共擴出161條多態性條帶，引物的PIC在0.64～0.89之間，SRAP 標記的遺傳相似性系數范圍為 0.67～0.97, 表明 96 份大蒜種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。對 96 份大蒜種質資源的 SRAP 分子標記進行聚類分析，在遺傳相似系數約為 0.83 時96 份大蒜種質資源分成 5 個群集。引物的多態性不僅反映了大蒜種質基因組的多態性，也反映了遺傳變異的差異性。

目前，有關大蒜種質資源的遺傳多樣性分析研究已有報道。劉新雨等[10]隨機選擇的14對SSR引物中有12對引物能進行有效擴增，其中有6對具有良好的多態性，多態率達50%，平均每對多態性引物可擴增得到4.33條帶，低于本研究的7.63條，表明SRAP標記對大蒜種質資源的多態性檢出率高于SSR。對35份大蒜種質資源進行遺傳多樣分析，結果顯示35份種質可聚為五大類群，遺傳相似系數為0.67～0.97, 高于本研究的0.70～0.97，說明本研究所采用的大蒜種質資源遺傳背景相對較窄，今后應加強大蒜種質資源的引進與利用。

本研究中大蒜的 SRAP 分子標記聚類分析結果與傳統的分類結果基本相同，但也存在差異，可能與取樣過程中量的多少、基因組 DNA 的提取方法、PCR 擴增體系的異同等有一定的關系。自然環境條件的復雜性、多樣性也可能是造成這種差異的原因。隨著標記技術的不斷成熟與應用，更多的分子生物學方法將被應用于大蒜種質資源的鑒定和親緣關系的研究中，如SSR[23]、ISSR、AFLP 等。在今后的研究工作中，應進一步采取多種分子標記法對同一大蒜種質資源的遺傳多樣性及親緣關系進行分析。