環境脅迫及脅迫解除對不同來源雪上一枝蒿種子萌發的影響

劉維暐， 趙麗偉， 黃 華， 明升平， 范中玉，李 金， 陳小靈， 和曉芬， 許 琨

(1.中國科學院昆明植物研究所麗江高山植物園， 云南 麗江 674100；2.麗江市玉龍納西族自治縣科學技術局， 云南 麗江 674100；3.麗江市玉龍納西族自治縣種子管理站， 云南 麗江 674100)

雪上一枝蒿(Aconitumbrachypodum)為毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)多年生草本植物，別名一支蒿、鐵棒錘、鐵牛七、三轉半等[1-2]。主要分布在云南東北部和西北部的東川、會澤、宣威、昭通、巧家、寧蒗、永勝、大理、麗江、香格里拉等地[3]，野生于海拔3 100～4 300 m的高山草地、多石礫山坡或疏林下。雪上一枝蒿是云南、四川民間廣為流傳和使用的跌打、療傷的止痛藥[4]，被用于治療風寒濕痹所致的筋骨和關節疼痛、跌打損傷所致的瘀血疼痛及蟲蛇咬傷等癥[5]。

雪上一枝蒿中的化學成分主要為二萜生物堿類[6-8]，以其為原料開發了雪上一支蒿總堿片劑、注射劑、骨痛靈酊以及搽劑、氣霧劑等制劑[9]。由于應用廣泛且野生資源相對匱乏，在云南麗江、曲靖，甘肅甘南等地，已開展了雪上一枝蒿的規模化種植工作[10-11]。盡管通過組織培養、根狀莖切塊也可以對雪上一枝蒿進行繁育[12]，但因雪上一枝蒿種子獲取較易，采收量較大，栽培種植基地主要采取種子撒播的方式對其進行繁育。

目前，雪上一枝蒿種植區域相對較廣，在我國多個省份均有人工栽培，但由于各地采收種子質量良莠不齊，成熟度不一致[13]，播種管理粗放，栽培基地土壤基質各異，導致雪上一枝蒿在實際生產過程中成苗量較低[14]。本實驗以不同來源地雪上一枝蒿種子為研究對象，研究不同環境條件對雪上一枝蒿種子萌發的影響，并探索脅迫條件下其種子的萌發特性及脅迫條件解除后種子恢復萌發的特征，以指導實際播種種植，從而緩解其野生資源不斷減少與市場需求不斷增加的矛盾。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2019年9—10月，采集甘肅省甘南藏族自治州舟曲縣、云南省麗江市玉龍納西族自治縣野生雪上一枝蒿種子作為實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1種子活力檢測

選取成熟飽滿，無病蟲害的雪上一枝蒿種子，按不同來源分組，每組選擇20粒，重復3次，沿種胚縱切后，分別置于蒸餾水(對照)及2%的氯化三苯四氮唑(TTC)染液中進行避光染色，20 min后將種子取出鏡檢，觀察染色情況并統計種子活力。

1.2.2環境脅迫對雪上一枝蒿種子萌發的影響

將采集的雪上一枝蒿種子，每150粒為一組，每組3個重復，每個重復50粒，置于鋪設有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養皿中。培養皿外側用塑料保鮮膜包裹，防止內部溶液揮發帶來濃度及pH值變化的影響。經不同脅迫條件處理后，于光照培養箱中培養，待萌發終止后統計萌發時間及萌發率。

具體脅迫條件包括：

1)溫度脅迫。設置10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃溫度梯度，觀察溫度對雪上一枝蒿種子萌發的影響；

2)酸堿度脅迫。設置pH值范圍為5.0～8.5，每0.5設置一個梯度，共8個pH梯度值溶液，在20 ℃恒溫條件下培養，觀察環境pH值對雪上一枝蒿種子萌發的影響；

3)鹽分脅迫。配置NaCl水溶液，按質量分數0.1%、0.5%、1%、5%設置濃度梯度，以蒸餾水作為對照，在20 ℃恒溫條件下培養，觀察鹽分脅迫對雪上一枝蒿種子萌發的影響。

1.2.3解除環境脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發情況

1)解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發情況。

將低溫(10 ℃)及高溫(30 ℃)條件下20 d后，取出未萌發的種子，置于鋪有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養皿中，于光照培養箱中20 ℃恒溫培養，觀察記錄雪上一枝蒿種子恢復萌發的情況。

2)解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發情況。

將不同NaCl濃度梯度下15 d后未萌發的種子取出，用蒸餾水沖洗干凈后，置于鋪有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養皿中，于光照培養箱中20 ℃恒溫培養，觀察記錄雪上一枝蒿種子恢復萌發的情況。

3)未萌發雪上一枝蒿種子活力檢測。

30 d后將未萌發的雪上一枝蒿種子取出，沿種胚縱切后，分別置于蒸餾水(對照)及2%的TTC染液中進行避光染色，20 min后將種子取出鏡檢，觀察染色情況并統計種子活力。

1.3 數據分析

實驗數據采用Microsoft excel 2016軟件進行處理，采用SPSS 24.0軟件進行統計分析及作圖。

2 實驗結果

2.1 雪上一枝蒿種子活力統計

由表1可以看出，不同來源地成熟的雪上一枝蒿種子生活力有顯著差異，在后續實驗結果分析過程中，以生活力測定值對萌發數據進行加權處理。

表1 不同來源雪上一枝蒿環境特征及種子活力檢測結果

2.2 環境脅迫對雪上一枝蒿種子萌發的影響

2.2.1溫度對雪上一枝蒿種子萌發的影響

由表2可以看出，20 ℃條件下雪上一枝蒿萌發率最高，不同來源雪上一枝蒿種子萌發率對溫度的響應不同。隨著溫度升高，雪上一枝蒿種子初始萌發時間提前(圖1)。低海拔地區(甘肅甘南舟曲)來源的種子在較低溫度(10 ℃)無法萌發(表2，圖1)；隨著溫度升高，雪上一枝蒿種子萌發能力先增強后減弱并受到抑制(圖1)，而高海拔地區(云南麗江玉龍)來源的種子受影響更為強烈(表2)，且在高溫(30 ℃)環境下無法萌發。

表2 雪上一枝蒿種子萌發率對溫度的響應

2.2.2酸堿度對雪上一枝蒿種子萌發的影響

pH值為5.0條件下，麗江玉龍雪山地區來源的種子萌發率降低，pH值8.5條件下，甘肅舟曲地區來源的種子萌發率顯著降低。除此以外，不同pH值環境下，雪上一枝蒿各組間種子萌發率沒有顯著差異。

由萌發進程(圖2)可以看出，不同pH值條件對不同來源雪上一枝蒿種子初始萌動時間及總體萌發時長影響不大。麗江玉龍雪山地區來源的種子萌發呈雙峰曲線，甘肅舟曲地區來源的種子呈單峰曲線。

2.2.3鹽分脅迫對雪上一枝蒿種子萌發的影響

由表3可以看出，在較低NaCl濃度(0.1%)下，雪上一枝蒿種子萌發率顯著降低，高海拔地區(云南麗江玉龍)來源的種子在0.5%NaCl濃度下仍可萌發。當環境NaCl濃度超過1%，種子無法萌發。

表3 不同pH值條件下雪上一枝蒿種子萌發率

表4 雪上一枝蒿種子萌發率對鹽分脅迫的響應

在NaCl脅迫條件下，雪上一枝蒿種子萌發進程縮短，萌發數量減少(圖3)。高海拔地區(云南麗江玉龍)來源的種子在0.5%NaCl濃度下萌發推遲。

2.3 解除環境脅迫后雪上一枝蒿的種子萌發特征

2.3.1解除溫度及鹽脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發受試樣本描述

（4）供求關系嚴重失衡，人員素質不高。建筑市場供求關系嚴重失衡，生產能力明顯過剩，過度競爭導致了無序競爭甚至是惡性競爭。

在溫度脅迫解除的實驗中，低溫組(云南玉龍)有部分種子萌發，取未萌發的種子；高溫組(甘肅舟曲)有部分種子萌發，取未萌發的種子。低溫脅迫組選擇10 ℃組，高溫脅迫組選擇30 ℃組，其中，受試樣本量描述如下：

1)云南麗江玉龍區域。低溫組(10 ℃)包括：第1組46粒、第2組45粒、第3組46粒；高溫組(30 ℃)每組50粒，3組。

2)Ⅱ甘肅甘南舟曲區域。低溫組(10 ℃)包括：每組50粒，3組；高溫組(30 ℃)包括：第1組34粒，第2組35粒、第3組36粒。

在鹽分脅迫解除的實驗中，取每個鹽分脅迫條件下未萌發的種子，以保持受試種子為同一批并減少干擾，解除脅迫后受試樣本量描述如下：

1)云南麗江玉龍區域。0.1%濃度包括：第1組46粒，第2組45粒，第3組47粒；0.5%濃度包括：每組46粒，3組；1%濃度包括：每組50粒，3組；5%濃度包括：每組50粒，3組。

2)甘肅甘南舟曲區域。0.1%濃度包括：第1組32粒，第2組31粒，第3組33粒；0.5%濃度包括：每組50粒，3組；1%濃度包括：每組50粒，3組；5%濃度包括：每組50粒，3組。

2.3.2解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子萌發特征

表5 解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子萌發率特征

解除環境溫度脅迫后，雪上一枝蒿種子萌發時間均大大提前(1～2 d內即開始萌發)，萌發進程縮短(由6～9 d縮短至3～7 d)(圖4)。

2.3.3解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子萌發特征

麗江玉龍雪山地區來源的種子經過鹽分脅迫后，沒有萌發的種子已經死亡(表6)；甘肅舟曲地區來源的種子在0.5%NaCl濃度下即沒有萌發，一旦環境脅迫解除，仍保持較高萌發率。當環境NaCl濃度超過1%后，所有種子均無萌發。

表6 解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子萌發率特征

3 分析與討論

3.1 不同來源雪上一枝蒿種子萌發對環境因子的響應

不同來源地雪上一枝蒿種子對萌發環境溫度體現了一定的選擇和適應性，這是植物在野外生存過程中長期自然選擇的結果。趙迪等[15]研究指出，在同樣的溫度條件下，不同海拔下露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)高海拔來源種子萌發率高于低海拔來源，但整體萌發率較低，休眠現象明顯。本研究結果與之不一致，可能由于物種差異，種子休眠程度不同導致。此外，20 ℃條件為雪上一枝蒿最適萌發溫度，這與船盔烏頭(Aconitumnaviculare)[16]及工布烏頭(Aconitumkongboense)[17]萌發特性相一致。

土壤酸堿度常會干擾植物種子萌發和植株生長[18]，雪上一枝蒿種子萌發受萌發環境酸堿度影響較小，pH值在5.5～8.0范圍均可有效萌發。即使來源不同的種子，其萌發受酸堿度影響也較小。在雪上一枝蒿實際播種過程中，對播種基質酸堿度沒有明顯要求，但土壤酸堿度對植物生長過程的影響，還需進一步研究。在鹽脅迫下，除了部分沿海灘涂以及鹽堿地生長的植物外[19-20]，許多植物種子萌發和幼苗生長會受到明顯抑制，抑制程度與鹽濃度和植物自身耐鹽能力有關[21-23]。麗江玉龍雪山來源的雪上一枝蒿種子呈現一定的耐鹽性，這與其生長環境多為林緣荒地及流石灘下緣有關。盡管雪上一枝蒿種子具有一定耐鹽性，但其對鹽脅迫響應仍非常敏感，即使在0.1%NaCl濃度下，其萌發率也會顯著降低，在播種前期，應提前分析種植地的土壤含鹽量及鹽分組成并采取相應措施，以緩解鹽脅迫對種子萌發帶來的危害。

3.2 解除環境脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發

過低和過高的溫度會使膜的透性、膜結合的活性和酶變性而影響種子萌發[24]。溫度脅迫解除后，甘肅舟曲來源的雪上一枝蒿種子萌發可恢復到較高水平。麗江玉龍雪山來源的種子恢復萌發的能力顯著低于前者，且高溫脅迫下的種子恢復萌發的能力顯著低于低溫脅迫。研究結果一方面體現了環境條件改變后植物適應能力的強弱，同時也暗示麗江玉龍雪山地區來源的雪上一枝蒿在引種繁育過程中難度較大。盡管高海拔惡劣的環境條件(晝夜溫差、強紫外線)能刺激藥用植物次級代謝產物的積累[25]，藥效更佳，但考慮其繁育的難度及成本，在種植栽培管理過程中應綜合考慮種源來源對藥材生產的影響。

鹽脅迫對植物種子萌發的影響主要表現在降低種子發芽率，延長種子萌發進程，或者使種子失去活力[26-27]。結合鹽脅迫實驗以及脅迫解除實驗結果來看，不同來源雪上一枝蒿種子在應對環境鹽脅迫時策略不同。由于生長環境影響，麗江玉龍雪山來源的種子仍能在高鹽濃度下萌發生長，而不能萌發生長的種子則失活死亡；甘肅舟曲來源的種子則選擇抑制萌發，等待萌發環境適宜后再萌發生長。環境過濾對于不同區域相同物種種子萌發產生的影響不同，麗江玉龍雪山區域生長的植物種子活力較低、環境選擇壓力較大，部分強壯的種子在惡劣環境下也可以萌發生長；甘肅舟曲區域植物種子活力較強，環境選擇壓力較小，只會在適宜條件下萌發生長。