超聲波對綠豆種子生長發育的影響

閆延鵬， 鄭 杰， 張雪梅， 陳 宇， 李鴻淋， 崔建國，2

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054；2.重慶理工大學 藥物化學與分子藥理學重慶市重點實驗室, 重慶 400054)

超聲波是一種音調高于人類聽覺的聲音，頻率超過20 kHz，在眾多領域具有廣泛的應用。低頻超聲作為快速增強各種生物活性的方法，在過去的十年中得到了越來越多的關注，通過改變超聲參數，可以達到不同的物理、化學和生物效果，從而實現對目標細胞活性增強的目的[1]。低頻超聲波作用于生物體，具有多種生物效應，其中最主要的有機械效應、空化效應和熱效應[2]。已有研究表明，超聲可以通過多種途徑加速細胞生長，如升高細胞pH值[3-4]或Ca2+濃度[5-6]，改變細胞膜的通透性[7-8]等。

超聲技術在植物研究和農業生產中具有廣闊的應用前景。最早從Willian等[9]用超聲處理玉米種子使其產量增加35%，到后期關于黃精種子[10]、梭梭種子[11]和橫經席種子[12]等各種植物，研究者們都進行了大量的研究工作。但目前超聲對植物種子影響的研究大多缺少理論基礎，參數選擇存在一定的隨機性和盲目性，更多的是以實驗測試來探究超聲對種子生長的影響。

針對上述情況，從基礎理論出發研究超聲波對綠豆種子發芽率的影響，通過理論和頻率仿真得到了綠豆細胞的特征頻率，然后設計了一種超聲刺激裝置，該裝置可以對刺激環境進行檢測和控制，并且能夠及時調節超聲作用參數。利用該裝置分別研究了超聲頻率、刺激時間和正弦波信號激勵電壓對綠豆種子發芽指數的影響，在此基礎上研究了連續波和脈沖波超聲對綠豆發芽的影響，并創新性的提出了超聲協同低濃度氯化鈉對綠豆發芽影響的研究。

1 矩形細胞膜共振理論

綠豆種子多為矩形細胞[13]，設矩形細胞膜的長和寬分別為a和b，則細胞膜的振動值為[14]:

(1)

其中，Z為膜的位移，c為振動傳播速度，F(x，y，t)為矩形膜遭受的外力。根據初始條件和邊界條件[15]，薄膜勢能增量為：

(2)

動能表達式為：

(3)

(4)

設

(5)

(6)

其中，M為細胞膜單位面積的重量，T為細胞膜平均表面張力，所以

(7)

其中,σ為薄膜的表面密度。當振頻指標m=n=1時，細胞膜的基本特征頻率為：

(8)

2 矩形細胞特征頻率的仿真

使用COMSOL Multiphysics 5.4有限元仿真軟件對矩形細胞特征頻率進行了仿真。細胞膜主要由蛋白質、磷脂和碳水化合物組成，為了簡易化仿真，本文將綠豆種子細胞等同于均勻的長方體，根據各組分的平均密度，求解均值得到細胞膜的平均密度為1 080 kg·m-3，矩形細胞模型相關參數如表1所示[16-17]。

表1 細胞膜仿真材料參數

當細胞膜的泊松比為0.25，楊氏模量為400 Pa時，通過仿真計算可知，矩形細胞模型最小特征頻率為41.202 kHz，為了簡化仿真過程，超聲高次諧波產生的其余特征頻率暫時不予考慮。該特征頻率下的細胞模型振型如圖1所示，由于矩形的對稱性，圖1中的振型呈現對稱分布。

3 超聲刺激對綠豆生長的影響

3.1 超聲細胞刺激系統

超聲細胞刺激系統共包括冷卻箱、水浴箱控制裝置和超聲刺激驅動裝置三部分。冷卻箱主要是通過半導體制冷片進行冷卻箱內部循環水的降溫。超聲刺激驅動裝置主要包括信號發生器(北京普源RIGOL DG 1012)，ATA-10功率放大器(西安安泰電子科技有限公司，內部包括阻抗匹配器，機箱尺寸為260 mm×160 mm×60 mm)。

水浴箱控制裝置主要包括水浴槽、培養皿、顯示單元、壓電陶瓷超聲換能器(非聚焦型48 kHz、65 kHz和85 kHz)、溫度控制檢測單元、循環水控制單元以及中央控制單元等部分。綠豆種子最適生長溫度約為25 ℃，為了得到良好的刺激環境，本裝置通過DS 18 B 20溫度傳感器實時進行水溫檢測，溫度偏低時通過加熱片給予水溫補償，當水溫超過25 ℃時通過循環水控制單元和冷卻箱對水浴槽進行降溫。超聲換能器以陣列形式固定于水浴槽的底部背面，可以通過控制裝置對相應頻率的換能器進行選擇性激勵，因換能器在工作時會引起其正上方水槽底部水溫升高(當水浴箱循環水關閉時，約升溫1.0 ℃)可能會影響該位置處細胞的生長，如圖2所示，通過循環水控制單元驅動水泵均勻水浴槽內的水溫，并可起到一定的降溫作用。由于培養皿處于換能器上方10 mm左右處，經測得該處水溫升高不足0.2 ℃，故忽略水溫對綠豆生長的影響。

超聲細胞刺激系統如圖3所示。由信號發生器產生與換能器頻率匹配的具有特定激勵電壓的正弦信號，該信號傳輸到功率放大器(功率放大器增益×10,輸出阻抗為1Ω)產生實驗所需的超聲電功率，并最終驅動換能器產生超聲波作用于綠豆種子。

3.2 材料與方法

1)材料：市售新鮮綠豆種子。

2)前期準備：挑選實驗所需數量形態飽滿的綠豆種子，將綠豆種子用去離子水清洗兩次，并置于清水中浸泡3 h。使用清水浸泡綠豆可以提高種子含水量，解除休眠狀態，利于種子萌發，也可以增加種子內膠體的親水性，提高原生質的粘滯性。

3)實驗步驟：將每組(30個)綠豆置于培養皿中，分別放入水浴槽內并固定于對應換能器的上方10 mm左右處，調整好實驗參數，最后對綠豆進行規定時長的超聲刺激。

4)后期處理：將超聲刺激后的實驗組和空白超聲刺激的對照組綠豆種子在同一條件下統一培養。以12 h為一個周期統計發芽的綠豆數目，以芽長達到種子總長的一半為發芽標準。每組評判指標為種子發芽率和發芽指數[18]：

(9)

本實驗以第一周期種子的發芽個數進行分析，以下統稱第一周期發芽率為初始發芽率。

(10)

其中，GI為發芽指數，Dt為發芽周期，Gt為一個周期內發芽的種子個數。

3.3 超聲頻率對綠豆生長的影響

在相同刺激時間和正弦波信號激勵電壓下，分別用頻率為48 kHz、65 kHz和85 kHz的超聲波換能器產生超聲作用于綠豆種子。挑選4組浸泡后的飽滿綠豆種子，每組種子為30顆，空白超聲刺激組作為無超聲作用的空白對照組(ck)，超聲頻率分別為48 kHz、65 kHz和85 kHz的刺激組作為實驗組，每組刺激時間為35 min，信號激勵電壓為10 Vpp。每組實驗重復3次，統計3次實驗數據取平均值，如表2所示。依據表2數據得到經48 h(4個周期)后種子的發芽指數和初始發芽率(圖4)。

根據表2和圖4可知，實驗組種子的發芽率和發芽指數均高于對照組，表明超聲刺激對種子的生長活性和速度具有一定的促進作用。頻率為48 kHz時種子的發芽率和發芽指數均高于其余各實驗組，表明48 kHz超聲頻率相較于其他頻率更能夠使細胞實現共振，從而促進種子生長，與仿真所得的矩形細胞特征頻率基本一致。

表2 不同超聲頻率下種子的發芽率和發芽指數

3.4 刺激時間對綠豆生長的影響

挑選6組綠豆種子，每組30顆，對照組(ck)施加空白超聲刺激，超聲刺激時間分別為25 min、30 min、35 min、40 min和45 min的刺激組作為實驗組，各組超聲頻率為48 kHz，正弦波信號激勵電壓為10 Vpp，每組實驗重復3次，統計3次實驗數據取平均值，如表3所示。依據表3數據得到經48 h(4個周期)后種子的發芽指數和初始發芽率(圖5)。

表3 不同刺激時間下種子的發芽率和發芽指數

由表3和圖5可知，當以最佳超聲頻率和一定信號激勵電壓刺激綠豆種子時，種子的初始發芽率和發芽指數隨刺激時間的增加先升高后降低，在35 min時均達到最大。ck組、25 min組和45 min組的發芽指數差別不大，表明刺激時間較短對細胞活性影響不明顯，而時間過長則不利于細胞生長。刺激時間為45 min時盡管發芽指數和ck組相一致，但初始發芽率有所下降，表明過度的超聲刺激會降低細胞活性，對種子的初期萌發速度產生抑制作用。

3.5 信號激勵電壓對綠豆生長的影響

挑選4組綠豆種子，每組30顆，ck組給予空白超聲刺激，正弦波信號激勵電壓分別為5 Vpp、10 Vpp和15 Vpp的刺激組作為實驗組，各組超聲頻率為48 kHz，刺激時間為35 min，每組實驗重復3次，統計3次實驗數據取平均值，如表4所示。依據表4數據得到經48 h(4個周期)后種子的發芽指數和初始發芽率(圖6)。

表4 不同信號激勵電壓下種子的發芽率和發芽指數

由表4和圖6的實驗結果可知，在最佳超聲頻率和刺激時間條件下，實驗組綠豆發芽率和發芽指數均高于ck組，而5 Vpp組與ck組的發芽指數較為接近，表明超聲強度過低時不能對種子萌發產生明顯影響。當信號激勵電壓為10 Vpp時綠豆發芽指數最大，而當超聲強度過大時綠豆生長速度有所降低。通過上述實驗可知，超聲刺激綠豆的最佳參數是超聲頻率為48 kHz，刺激時間為35 min，信號激勵電壓為10 Vpp，后續實驗均在此條件下進行。

3.6 不同信號波形對綠豆生長的影響

挑選8組綠豆種子，每組30顆，其中一組為對照組給予空白超聲刺激，標記為ck，其余7組分別施加正弦信號、方波信號、三角波信號和不同占空比(20%、40%、60%和80%)的脈沖超聲信號。每組實驗重復3次，統計3次實驗數據取平均值，如表5所示。依據表5數據得到經48 h(4個周期)后種子的發芽指數和初始發芽率(圖7)。

由表5和圖7可知，不同波形條件下，經超聲刺激的實驗組初始發芽率和發芽指數均高于ck組，其中占空比為20%的脈沖信號綠豆發芽率最高，且高于ck組22%，表明脈沖波信號優于連續波信號，而且不同波形的連續信號實驗結果沒有明顯差異。隨著脈沖信號占空比的升高，發芽率逐漸下降，表明強度過大的超聲脈沖信號會對綠豆細胞生長產生一定程度的抑制，減緩其發芽速度，但積極影響高于消極影響。

表5 不同信號波形下種子的發芽率和發芽指數

3.7 不同NaCl鹽濃度下超聲刺激對綠豆生長的影響

根據文獻報道[19]，植物種子的萌發會隨著鹽濃度的升高而降低，究其原因是因為離子的毒害作用。針對上述情況，本文創新性的選用低濃度NaCl溶液研究綠豆的萌發情況。挑選9組綠豆種子，每組30顆，其中一組為對照組，其余8組為實驗組分別代表4種不同鹽濃度下(8.55 mmol·L-1、17.09 mmol·L-1、51.27 mmol·L-1和85.45 mmol·L-1)是否伴有超聲協同作用的情況，其中有超聲組標記為“鹽濃度+U”。每組實驗重復3次，統計3次實驗數據取平均值，如表6所示。依據表6數據得到經48 h(4個周期)后種子的發芽指數和初始發芽率(圖8)。

表6 不同NaCl鹽濃度下種子的發芽率和發芽指數

由表6和圖8可知，低濃度(8.55 mmol·L-1和17.09 mmol·L-1)鹽溶液對綠豆生長有一定的促進作用，當鹽溶液濃度過高，則會由于鹽脅迫的影響使綠豆發芽速度減慢并遠低于正常水平。實驗表明，當超聲與鹽溶液協同作用時，綠豆種子生長速度高于單一的鹽溶液條件，提高了種子的發芽率。當鹽濃度為8.55 mmol·L-1時，有無超聲刺激對綠豆生長影響不大，這可能是因為綠豆種子適應較低濃度鹽溶液，可以實現正常的離子交換而無需外力作用，當鹽濃度為17.09 mmol·L-1時，在超聲的協同作用下可以極大地促進綠豆發芽，并高于ck組41%。同樣，由于鹽脅迫的存在，即使給予超聲刺激，高濃度鹽溶液下種子發芽率會有所下降，雖然發芽率高于ck組，但長勢(種子根長)明顯較差。

綜上所述，在超聲刺激細胞的過程中，適當的超聲參數能使細胞最大限度產生共振，經超聲處理的種子表面呈現出許多小孔[19]，結合超聲的機械作用從而改變細胞膜通透性，促進細胞生長與增殖，提高種子的發芽速度與發芽率。

4 結 論

通過建立綠豆種子矩形細胞模型對其特征頻率進行理論分析，并通過有限元仿真得到細胞特征頻率，從而確定超聲頻率的選擇范圍。根據實驗需要自行設計了一種超聲刺激裝置，該裝置采用的超聲換能器以陣列形式固定于水浴槽底部背面，可實現水溫的檢測與控制、水流量調節以及超聲換能器頻率選擇等功能，該裝置集多功能于一體，操作簡單，使用便捷。

使用自制裝置對綠豆種子進行超聲刺激實驗，分別研究了超聲頻率、刺激時間和信號激勵電壓對綠豆發芽的影響，并在此基礎上研究了連續波和脈沖波超聲以及超聲協同不同濃度的氯化鈉對綠豆發芽的影響。實驗結果表明，在適當的超聲頻率范圍內，刺激時間不足或信號激勵電壓過低不能對種子產生明顯影響，當實驗參數超出一定范圍則會對種子初期生長速度產生抑制作用。通過多次實驗得到綠豆發芽的最優方案為當脈沖波占空比為20%時，在48 kHz、35 min、10 Vpp條件下綠豆發芽率最高，最佳頻率與仿真計算所得的矩形細胞特征頻率(41.202 kHz)基本一致，而且體積摩爾濃度為17.09 mmol·L-1的NaCl協同超聲處理可以極大地加速綠豆發芽。對于陳年種子來說，由于儲存時間過長導致種子活力損失，發芽率大幅下降，不利于后期的培育。因此，本研究提供了一種新的思路，通過超聲與低濃度的NaCl溶液協同作用，以實現種子的高發芽率。