雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷

方 舟，張軍兵，羅忠國(guó)，熊 勇,*，羅舜菁，劉成梅

1.南昌大學(xué) 食品學(xué)院 (南昌 330000)2.江西丹霞生物股份有限公司 (鷹潭 335000)

紫甘薯色素是從紫甘薯的塊根中提取精制而成的一種花色苷類色素，其中主要的花色苷配基為矢車菊色素和芍藥色素，且以單酰基化和雙酰基化的花色苷為主[1]。與其它花色苷類色素相比，紫甘薯色素具有酰化基團(tuán)，從而具有較好的耐熱性和耐光性[2]。同時(shí)，其對(duì)光、熱、酸和堿等的敏感度要比一般無(wú)酰基化的花色苷小，因而性質(zhì)更加穩(wěn)定[3]。花色苷具有極強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為自由基清除劑[1]，除此之外，花色苷還具有抗癌[4]、抗炎[5]等多種功能。

影響紫甘薯花色苷純度的主要是淀粉及其他糖類雜質(zhì)，目前對(duì)花色苷進(jìn)行分離純化的方法有大孔樹(shù)脂法[6]、膜分離法[7-8]、色譜法[9]等，這些方法存在時(shí)間長(zhǎng)、易污染或成本高等問(wèn)題。雙水相技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離方法相比，具有條件溫和、產(chǎn)品活性損失小、步驟簡(jiǎn)單及分離效果好等優(yōu)點(diǎn)[10]，國(guó)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化及抗生素的提取，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于天然色素的分離純化研究。紫甘薯花色苷的高效分離純化是進(jìn)行其功能性研究和對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用的基礎(chǔ)。本研究利用雙水相技術(shù)對(duì)紫甘薯花色苷進(jìn)行分離純化并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為紫甘薯色素的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯濃縮液(花色苷含量為2.229 3 mg/mL，糖含量為409.793 8 mg/mL)，由江西丹霞生物科技有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；硫酸銨、磷酸二氫鈉、氯化鉀、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、苯酚、硫酸、鹽酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純；無(wú)水乙醇，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度儀，北京普析通用公司；超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司；旋渦攪拌器(mini G)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1不同鹽種類和濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加4.8 g、5.4 g、6.0 g、6.6 g和7.2 g的硫酸銨[(NH4)2SO4]和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，各管中加入無(wú)水乙醇7.5 g，紫甘薯濃縮液1 mL，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，此時(shí)各管中的鹽濃度分別為16%、18%、20%、22%、24%，研究不同鹽濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響。

1.3.2不同乙醇濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加7.5 g、9.0 g、10.5 g、12 g和13.5 g的無(wú)水乙醇，各管中加入鹽6.0 g，紫甘薯濃縮液1 mL，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，此時(shí)各管中的乙醇濃度分別為25%、30%、35%、40%、45%，研究不同乙醇濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響。

1.3.3不同濃縮液添加量對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、和1.2 mL 的紫甘薯濃縮液，各管中加入鹽6.0 g，無(wú)水乙醇7.5 g，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，研究不同濃縮液添加量對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

1.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇鹽濃度、乙醇濃度和濃縮液添加量為考察因素，以花色苷回收率和糖殘留率作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。花色苷回收率表明在經(jīng)過(guò)雙水相體系處理后花色苷能夠保留的比例；由于在紫甘薯濃縮液中的主要雜質(zhì)為糖類，糖殘留率則表明雙水相體系對(duì)于紫甘薯花色苷的純化能力。

表1 L9(33)正交因素實(shí)驗(yàn)表

1.5 測(cè)定方法

1.5.1花色苷的測(cè)定

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.244—2016的方法對(duì)花色苷進(jìn)行測(cè)定，以矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)。花色苷的含量計(jì)算如下：

式中：A為(A520 nm-A700 nm)pH 1.0-(A520 nm-A700 nm)pH 4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(M=449.2 g/mol),g/mol；f為樣品的稀釋倍數(shù)；k為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(ε=26 900)，L/(mol·cm)；l為光路長(zhǎng),cm；V為樣品體積，mL。

花色苷回收率計(jì)算如下：

式中：W花為花色苷回收率；A上花為雙水相體系中上相的花色苷總量；A總花為加入雙水相體系中的花色苷總量。

1.5.2糖類的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖25 mg于250 mL容量瓶中，定容，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL葡萄糖溶液以蒸餾水補(bǔ)至10.0 mL，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的葡萄糖溶液，各取1.0 mL置于比色管中，分別加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL搖勻，室溫反應(yīng)30 min以后于490 nm測(cè)吸光度，以1.0 mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為多糖毫克數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)曲為y=0.132 5x，R2=0.998 7。

對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后以上述方法進(jìn)行顯色操作后以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

糖殘留率的計(jì)算如下：

式中：W糖為糖殘留率；A上糖為雙水相體系中上相的糖類總量；A總糖為加入雙水相體系中的紫甘薯濃縮液所含的糖類總量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同鹽種類和濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖1所示，隨著鹽濃度的上升，花色苷的回收率呈上升趨勢(shì)，而糖殘留率則呈下降趨勢(shì)，因此鹽濃度的增加對(duì)于雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷是有著顯著作用的。可以看到在降低糖殘留率方面，硫酸銨的效果更顯著，但是對(duì)于花色苷的回收來(lái)說(shuō)，磷酸二氫鈉的效果更好。因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，選擇磷酸二氫鈉作為成相鹽。

圖1 鹽的種類及濃度對(duì)花色苷回收率的影響

雖然鹽的濃度增加，有利紫甘薯色素的分離純化，但是在一定條件下鹽的飽和濃度為其濃度極限，鹽濃度增加，鹽在上相的殘留率同時(shí)增加，因此鹽的濃度并非越高越好。當(dāng)鹽的濃度達(dá)到22%時(shí)，對(duì)于花色苷的回收率及糖殘留率的變化較小，因此選擇鹽濃度為22%。

2.1.2不同乙醇濃度對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，花色苷的回收率增加，但糖殘留率也同時(shí)增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，鹽溶液達(dá)到飽和，開(kāi)始有鹽析出，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到45%時(shí)，鹽進(jìn)一步析出，導(dǎo)致無(wú)法成相。由于過(guò)高或過(guò)低的乙醇濃度會(huì)影響雙水相體系的形成，且對(duì)糖殘留率也有明顯影響。因此選擇乙醇濃度為25%。

圖2 鹽的種類及濃度對(duì)糖去除率的影響

2.1.3不同濃縮液添加量對(duì)紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖3所示，可以看到隨著濃縮液添加量的增加，花色苷的回收率由接近100%下降至75.97%，糖殘留率也同樣隨著濃縮液的變化而逐漸減少。濃縮液的添加量對(duì)于花色苷的回收率和糖殘留率有著較大的影響，綜合考慮花色苷回收率及糖殘留率，選擇濃縮液的添加量為0.8 mL。

圖3 乙醇濃度對(duì)花色苷回收率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，分別以花色苷回收率和糖殘留率為考察指標(biāo)，由極差r可以看出對(duì)花色苷回收率來(lái)說(shuō)三個(gè)因素的影響大小依次為濃縮液添加量、磷酸二氫鈉濃度、乙醇濃度，最優(yōu)工藝為A1B1C1，即磷酸二氫鈉濃度為20%，乙醇濃度為25%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.63%，糖殘留率為55.78%；而由極差R則可以看出對(duì)糖殘留率來(lái)說(shuō)三個(gè)因素的影響大小依次為磷酸二氫鈉濃度，乙醇濃度，濃縮液添加量，最優(yōu)工藝為A2B2C1，即磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%，糖殘留率為42.51%。

表2 雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷的正交因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 乙醇濃度對(duì)糖殘留率的影響

圖5 濃縮液添加量對(duì)花色苷回收率的影響

圖6 濃縮液添加量對(duì)糖回收率的影響

兩組工藝的花色苷回收率分別為99.63%和99.31%，相差不大，但糖殘留率則分別為55.78%和42.51%，有明顯差別。考慮到對(duì)紫甘薯花色苷進(jìn)行分離純化的目的，因此綜合考慮選取的最佳工藝為為A2B2C1，即磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%，糖殘留率為42.51%。

3 結(jié)論

采用磷酸二氫鈉/乙醇雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)并綜合考慮糖殘留率和花色苷回收率，選取的最佳工藝為為磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%。顯然，磷酸二氫鈉/乙醇雙水相體系對(duì)紫甘薯花色苷有良好的選擇性并能有效去除糖類雜質(zhì)。通過(guò)對(duì)雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷的研究，優(yōu)化了其工藝，為紫甘薯花色苷的產(chǎn)業(yè)化及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。