菌株Pseudomonas sp. FA4對4-氟苯胺的降解性能及其生物膜形成特性

陳 諾，趙芝清，鄭夢婷，雷宇芬，沈駱秦，吳燕君

（衢州學院 化學與材料工程學院，浙江 衢州 324000）

有機氟化物因其優(yōu)異的性能廣泛應用于制藥、印染、化工、軍事等領域［1-2］。然而，除了自然界存在的五十幾種外，有機氟化物大多為人工合成，屬于難生物降解化合物，在水體、土壤、大氣中均有所累積，且具有“三致”性［3-5］。目前，含氟化合物的有效處理已成為研究的熱點和難點。迄今為止，相關學者已報道了化學法［6］、物理法［7］和生物法［8］等含氟化合物處理方法。其中，生物法因其處理成本低、不易產生二次污染等優(yōu)點備受青睞。生物強化技術是指向生物處理系統(tǒng)中引入具有特定降解功能的微生物，提高有效微生物的濃度，從而改善原有生物處理體系的廢水處理效果［9］。近年來，相關學者已從環(huán)境中分離得到了多株有機氟化物高效降解菌［10-12］。生物強化技術成敗的關鍵是降解功能菌株能否快速定植，而生物膜的形成對菌株的定植具有重要影響。生物膜形成過程中，除受微生物自身一些內在機制調控外［13-14］，還受水質條件和水力條件等影響，如pH、鹽度和重金屬等［15］，而當前有關此方面的研究甚少。

本研究以前期篩選得到的一株4-氟苯胺（4-FA）高效降解菌——假單胞菌FA4（Pseudomonassp. FA4）為研究對象，重點考察了pH、重金屬等環(huán)境因子對其降解性能和生物膜形成的影響，以期為調控該菌株在實際廢水處理中的應用提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

所用試劑均為國產分析純。

4-FA高效降解菌：本課題組前期篩選得到的假單胞菌（Pseudomonassp.），命名為菌株FA4。

培養(yǎng)基：4-FA0.5 g/L，Na2HPO4·2H2O 2.7 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，MgCl20.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，CaCl20.01 g/L，酵母提取物 0.02 g/L，微量元素溶液Ⅰ和溶液Ⅱ［16］各1.0 mL/L，pH 7.2。121 ℃高壓滅菌30 min。固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為15～20 g/L，半固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為5～8 g/L。

Waters高效液相色譜儀：2487型雙波長紫外檢測器，717型自動進樣器，沃特世科技（上海）有限公司；Amethyst C18型色譜柱：4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm，蘇州賽分科技有限公司；722N型可見光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；Sigma 1-13型離心機：德國Sigma實驗室離心機股份有限公司。

1.2 菌株FA4降解能力的影響

設置不同環(huán)境因子（4-FA初始質量濃度、pH、重金屬種類），考察菌株FA4降解能力的變化：1） 按10%的接種量將600 nm處吸光度（OD600）約為0.5的菌液分別接種至含100～2 400 mg/L 4-FA的培養(yǎng)基中，以30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d后，取樣測定4-FA和氟離子的質量濃度、溶液OD600以及1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活；2）用濃度為1.0 mol/L的HCl和NaOH 溶液分別調整培養(yǎng)基pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10，接種振蕩培養(yǎng)3～4 d后取樣分析；3）分別稱取一定量的重鉻酸鉀、氯化鎳、氯化銅和氯化鋅至培養(yǎng)基中，使Cr（Ⅵ）、Ni2+、Zn2+和Cu2+的質量濃度均為10 mg/L，接種振蕩培養(yǎng)3～4 d后取樣分析，同時設置不投加金屬離子的對照組，記為CK。

1.3 生物膜形成的影響

基于實際廢水組分，重點考察了pH、金屬離子種類和NaCl質量濃度對菌株FA4生物膜形成的影響，具體條件如下：1）用HCl和NaOH溶液分別將培養(yǎng)基pH調至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，分別取2 mL培養(yǎng)基裝至18支φ10 mm×75 mm試管中，在接種量10%、30 ℃、120 r/min條件下接種、振蕩培養(yǎng)3～4 d；2）向培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+，設置0，1，5，10，20 mg/L 5個水平，培養(yǎng)條件同上；3）向培養(yǎng)基中添加不同質量的NaCl，使NaCl的質量分數(shù)分別為0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)完成后測定生物膜形成量，每個水平設置3個平行試樣。

1.4 細菌群游能力的影響

分別配制不同pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0）、不同NaCl質量濃度（0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%）和分別含10 mg/L金屬離子（Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+）的半固體培養(yǎng)基，接種OD600約為0.5的菌液1 μL，30 ℃培養(yǎng)3～4 d后測定細菌群游直徑［17］。每個水平設置3個平行試樣。

1.5 分析方法

4-FA的質量濃度采用高效液相色譜法測定［16］：水樣經(jīng)12 000 r/min離心5 min并經(jīng)過0.22 μm水系濾膜過濾；流動相為甲醇-水溶液（體積比7∶3），柱溫 35 ℃，檢測波長為230 nm。

1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活測定方法見文獻［16］；氟離子質量濃度的測定采用氟離子電極法［18］；OD600的測定采用可見光分光光度法。

生物膜形成量的測定采用結晶紫染色法［17］：試管管壁上的生物膜以結晶紫染色后再用乙醇-丙酮溶液（體積比80∶20）洗脫，測定洗脫液在波長570 nm處的吸光度（OD570），以OD570表征生物膜形成量。

2 結果與討論

2.1 不同因子對菌株降解4-FA、脫氟及生長的影響

2.1.1 初始濃度

4-FA初始濃度對菌株FA4降解能力的影響見圖1。由圖1可知：菌株FA4可有效降解初始質量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，去除率維持在90.00%以上；隨4-FA初始質量濃度的增大，脫氟率由80.00%左右降至42.90%（最高80.60%），OD600則先由0.139升至0.763再降至0.696。SONG等［8］報道4-FA降解菌株羅爾斯通氏菌（Ralstoniasp.）FD-1的最高可降解質量濃度為1 500 mg/L，故菌株FA4具有良好的降解能力。

圖1 4-FA初始質量濃度對菌株FA4降解能力的影響

采用質量濃度為500 mg/L的4-FA培養(yǎng)3 d后，測定菌液的酶活。結果顯示，菌液的1，2-雙加氧酶的酶活為（0.027 0±0.002 5）μmol/（mg·min）（以每mg蛋白計），2，3-雙加氧酶的酶活基本未檢測到。由此可推測，4-FA主要通過鄰位開環(huán)實現(xiàn)轉化降解。

2.1.2 金屬離子種類

不同金屬離子的種類和濃度會對生化處理系統(tǒng)產生不同的毒性。WANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/L的Ni2+對生化系統(tǒng)的TOC去除率影響不大，而當質量濃度升至10 mg/L時則呈現(xiàn)明顯的抑制。CHENG等［20］報道，5 mg/L的Cr（Ⅵ）即可使生化處理系統(tǒng)的基質去除率急劇下降。鮑雪飛［21］研究發(fā)現(xiàn)，9 mg/L的Cu2+可使生物系統(tǒng)的COD去降率下降54.11%。鑒于此，重點考察了10 mg/L的Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）對菌株降解能力的影響。在質量濃度均為10 mg/L的條件下，金屬離子種類對菌株FA4降解能力的影響見圖2。由圖2可知：相比CK，10 mg/L Ni2+和Cr（Ⅵ）均對4-FA去除率無較大影響；Zn2+對脫氟過程呈現(xiàn)了促進作用；而Cu2+則呈現(xiàn)了較為明顯的抑制作用，4-FA去除率從100%降至53.44%，脫氟率則由76.82%降至3.44%。可見，菌株FA4對Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。另一方面，在Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）存在下，相比CK，OD600均有所增加，分別由0.250增至0.286、0.305、0.407和0.333。金屬離子環(huán)境下，為了保護細胞免受侵害，微生物通常會分泌出更多的胞外聚合物（EPS），從而影響了OD600的測定。

圖2 金屬離子種類對菌株FA4降解能力的影響

2.1.3 pH

pH對菌株FA4降解能力的影響見圖3。由圖3可見：當pH為6.0～10.0時，4-FA去除率基本維持在99%以上，脫氟率則隨著pH增大而先增加后減小，于pH=7.0時達到最大（90.00%）；當pH=6.0時，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別為99.67%、65.63%和0.162；而當pH降至5.0時，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別降至53.72%、5.51%和0.093。這說明菌株FA4更適宜在中性的環(huán)境中生長。

圖3 pH對菌株FA4降解能力的影響

2.2 不同因子對菌株FA4生物膜形成的影響

生物膜是細菌細胞在受到pH、鹽度等環(huán)境因子的刺激或誘導后，發(fā)展出的一種具有“應激”特征的集體生長形態(tài)［22-23］，其形成過程因細菌的種類而異。

2.2.1 pH

pH對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖4。由圖4可見，當pH由5.0升至10.0時，OD570先增大后減少，當pH為7.0時達到最大（0.236），pH為6.0和8.0時次之，基本與降解特性變化趨勢一致（見圖3）。表明中性環(huán)境更有利于生物膜的形成，偏酸或偏堿的環(huán)境不利于生物膜的形成。

圖4 pH對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.2.2 NaCl質量分數(shù)

NaCl質量分數(shù)對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖5。

圖5 NaCl質量分數(shù)對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

由圖5可見：當NaCl質量分數(shù)為0～0.25%時，OD570約為0.203，隨著NaCl質量分數(shù)的增加OD570基本保持不變，可能是因為低濃度NaCl對菌的生長無影響，沒有激發(fā)菌株的“應激”響應體系；當NaCl質量分數(shù)進一步提升至0.50%和1.00%時，OD570分別為0.267和0.296，表明生物膜形成量明顯增大，可能是因為菌株在脅迫條件下啟動了“應激”自我保護，分泌了較多的EPS，從而提高了生物膜形成量；而當NaCl質量分數(shù)繼續(xù)增加到2.00%時，OD570約為0.219，表明生物膜形成量顯著下降，可能是由于NaCl質量分數(shù)過高導致脫氫酶失活，菌體無法分泌更多的EPS進行自我保護。張?zhí)m河等［24］研究發(fā)現(xiàn)，NaCl質量分數(shù)小于0.5%時微生物產生的EPS相對穩(wěn)定，而當NaCl質量分數(shù)大于0.5%時，EPS也快速增多，以抵抗?jié)B透壓升高對細胞的破壞。可見，NaCl質量分數(shù)為0.50%～1.00%的生長環(huán)境有利于菌株FA4生物膜的形成，這也與熊富忠等［15］的研究結論基本一致。

2.2.3 重金屬種類及濃度

重金屬種類及濃度對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖6。由圖6可見：Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）質量濃度為0～20 mg/L時，Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）對OD570均未有明顯的影響；未添加Ni2+培養(yǎng)時的OD570為0.269，添加1，5，10，20 mg/L的Ni2+后的OD570分別為0.325，0.509，0.450，0.476，經(jīng)差異性分析發(fā)現(xiàn)，5～20 mg/L的Ni2+對生物膜形成具有促進作用，與相關報道一致［25］。因此，投加5～20 mg/L的Ni2+有利于促進菌株FA4生物膜的形成。

圖6 重金屬種類及濃度對菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.3 菌株FA4的群游能力

具有強運動能力的細菌通常能快速與材料表面發(fā)生初始黏附，繼而增殖、擴張，形成生物膜［26］。不同環(huán)境因子條件下菌株FA4的群游直徑見圖7。由圖7a可見，當pH由5.0升至10.0時，群游直徑先增大后減少，其中當pH為7.0時達到最大，為5 mm。由圖7b可見，當NaCl質量分數(shù)為0.10%～1.00%時，群游能力與NaCl質量分數(shù)為0時基本相當，維持在4～5 mm，而當NaCl質量分數(shù)繼續(xù)增加到2.00%時，群游能力則顯著減小，僅為3 mm。由圖7c可見，相比CK，10 mg/L的 Cu2+和Cr（Ⅵ）使菌株FA4的群游能力有所降低，而Zn2+和Ni2+對群游能力的影響不明顯。該結果基本與2.23節(jié)的結論相一致。

圖7 不同環(huán)境因子條件下菌株FA4的群游直徑

3 結論

a）菌株FA4能有效降解質量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，4-FA去除率維持在90.00%以上，脫氟率為42.90%～80.60%。菌株FA4最適生長pH為7.0，對10 mg/L 的Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。

b）菌株FA4生物膜形成的最適條件為pH=7.0、NaCl質量分數(shù)0.50%～1.00%，投加5～20 mg/L的Ni2+可促進菌株FA4生物膜的形成。

c）就菌株FA4群游能力而言，最適條件為pH=7.0、NaCl質量分數(shù)0 ～1.00%，10 mg/L的Zn2+和Ni2+均未對菌株FA4群游能力產生明顯影響。