還原氧化石墨烯/泡沫銅電極用于微生物電合成系統中二氧化碳合成有機物

廖夢根，王 黎，柳 焜，胡 寧，余 楊

（武漢科技大學 環境污染綠色控制與修復技術研究中心，湖北 武漢 430081）

CO2是溫室氣體的主要成分之一，近年來森林的大量砍伐導致CO2的固定受到影響，需要找到替代的方法。利用生物電化學生產燃料受到了眾多科學家的廣泛關注［1-3］。在眾多CO2還原方法中，微生物電合成系統（MES）是最有效的方法之一，不但反應速率可控，而且產物選擇性高［4］。陰極材料、陰極微生物、陰極電勢、質子交換膜等材料的選擇會對MES系統的合成效果產生影響［5-7］。DONG等［8］通過構造包含粒狀活性炭顆粒的流化三維電極使乙酸的體積產率提高了2.8倍。VU等［9］通過在MES中加入導電納米磁鐵使甲烷產率提高了22.1%。ARYAL等［10］修改3D石墨烯網絡，使CO2電合成乙酸的速率提高了6.8倍。陰極材料作為MES的核心可使微生物更加高效地進行電子轉移，其表面可形成致密的生物膜并完成底物的質量傳遞［11-13］。泡沫銅（CuF）的三維多孔網狀結構具有電導率高、比表面積大、有利于微生物附著、成本低廉等優點，完美地契合了電極材料的選擇要求。

本工作將金屬電極與碳基材料相結合，制備了還原氧化石墨烯/泡沫銅電極，對微生物沒有排斥作用，并且提高了CO2電合成有機物的產物轉化效率。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

MES菌種來自武漢市某污水處理廠厭氧池的活性污泥。

泡沫銅：孔隙率0.88，昆山富匯立電子有限公司；陽離子交換膜：美國萘酚公司；鈦板：歐帝富有限公司；鈦絲：歐帝富有限公司；天然鱗片狀石墨：南京嘉慧碳素材料有限公司。

所用試劑均為分析純。CO2，N2：純度大于99.999%。

XL30 ESEM-TMP型環境掃描電子顯微鏡：荷蘭Philips公司；ISC-90型高效液相色譜儀：塞默飛世爾科技公司；TRACE1300型氣相色譜儀：塞默飛世爾科技公司；PB-10型精密pH 計：上海佑科儀器儀表有限公司；218型Ag/AgCl參比電極：相對于氫標準電極電位為+197 mV，上海雷磁儀器有限公司；CHI660E型電化學工作站：上海辰華儀器有限公司。

1.2 MES

MES的陰極室與陽極室間用陽離子交換膜隔開。陽離子交換膜在使用前分別用30%（w）過氧化氫溶液、0.5 mol/L濃硫酸和去離子水煮沸1 h進行預處理，以增加孔隙率并激活負責離子轉移的磺化基團。陰、陽2室的有效容積均為600 mL，用直徑0.5 mm的鈦絲作導線，陰極以還原氧化石墨烯改性后的泡沫銅（5.00 cm×5.00 cm×0.02 cm）作為工作電極，陽極以鈦板（6.00 cm×6.00 cm×0.05 cm）作為對電極，參比電極采用Ag/AgCl電極并置于陰極電解室中。

陽極室電解液：濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液，pH＝6.8。

陰極室液體培養基： K2HPO42.18 g/L，KH2PO41.70 g/L，NH4Cl 1.25 g/L，KCl 0.10 g/L，NaCl 0.80 g/L，MgCl2·6H2O 1.00 g/L，CaCl2·2H2O 0.30 g/L，NaHCO32.50 g/L，維生素溶液 10 mL/L，微量元素溶液 10 mL/L，pH ＝6.8。

1.3 實驗方法

1.3.1 氧化石墨烯的制備

先用改良Hammers法［14］制備氧化石墨烯。用稀鹽酸洗滌產物至pH=7，再用去離子水充分洗滌至濾液中無SO42-，最后用真空干燥箱干燥24 h。

1.3.2 還原氧化石墨烯/泡沫銅電極的制備

按照文獻［10］的方法將氧化石墨烯涂覆在泡沫銅上，隨后將覆蓋氧化石墨烯的泡沫銅用60 mL含量為0.5 mg/mL的抗壞血酸溶液還原2 h。用超純水充分洗滌還原氧化石墨烯/泡沫銅電極，最后將還原氧化石墨烯/泡沫銅電極放入真空干燥箱干燥12 h。

1.3.3 MES中有機物的CO2還原合成

分別取50 mL馴化好的活性污泥接入改性泡沫銅MES（改性后MES）［10］和未改性泡沫銅MES（改性前MES）中，同時在陰極室中加入500 mL液體培養基。通過向陰極室中加入2-溴乙基磺酸鈉抑制污泥中產甲烷菌的活性［15］。設置陰極電勢為-0.8 V（vs Ag/AgCl），反應溫度為（36±1）℃，陰極液pH為（6.0±0.1）。在陰極室的底部通入CO2進行微孔曝氣（曝氣流量20 mL/min，曝氣時間40 min，靜止時間4 h）。陽極進行沒有微生物的氧化反應，陰極進行有電化學功能菌的還原反應。反應溫度用數顯恒溫水浴鍋進行控制，反應裝置穩定運行即成功啟動。同時設置無微生物對照組，其運行條件均與實驗組一致。

1.4 分析方法

1.4.1 微生物形態的SEM表征

用無菌剪刀從陰極泡沫銅上剪取1 cm×1 cm大小的薄片，用w=2.5%的戊二醛溶液固定24 h；分別用w=25%，50%，70%，85%，95%，100%的乙醇各脫水1次，每次15 min；最后用乙酸異戊酯置換2次，每次15 min。試樣干燥后噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察陰極電極上微生物的形態。

1.4.2 電化學分析

MES穩定運行一段時間后，陽極連接對電極，陰極連接工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，記錄電流隨時間的變化情況。在本研究中，所有的電位數據均相對于Ag/AgCl參比電極，電壓輸出、電流監測均采用電化學工作站。一個周期運行結束后，進行數據分析，對時間與電流積分，計算出一個運行周期輸入的電量。設置工作電壓為-0.8 V，掃描頻率為0.01 kHz～100 kHz，振幅為5 mV，通過等效電路模型得到陰極的電化學阻抗。利用電化學工作站對MES進行循環伏安掃描，掃描參數：掃描電勢范圍-1.0 V ～0.8 V，掃描頻率0.005 V/s。

1.4.3 電化學功能菌的DNA高通量測序

采用454高通量測序技術［16］對MES反應前和反應10 d后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物群落進行DNA高通量測序。

2 結果與討論

2.1 SEM分析

改性前后泡沫銅電極的SEM照片見圖1。由圖1a可以看出泡沫銅的表面為三維多層孔洞結構，為其提供更大的比表面積。由圖1b可見少量微生物附著在泡沫銅表面。由圖1c可以明顯看到改性后的泡沫銅電極表面覆蓋了一層還原氧化石墨烯，顯著增加其比表面積。由圖1d可見，改性的泡沫銅電極表面附著了更多的微生物，微生物的形態多樣，主要以桿狀菌為主，且微生物主要附著在還原氧化石墨烯上。這表明還原氧化石墨烯相比泡沫銅更有利于微生物的附著生長，改性后的電極材料具有良好的生物親和性。

圖1 改性前后泡沫銅電極的SEM照片

2.2 電化學分析

2.2.1 電流

在MES運行期間，用電化學工作站記錄改性前后MES與無微生物對照組的電流變化情況，其電流隨反應時間的變化見圖2。

由圖2可見，在改性前MES的最大電流為26.28 mA，改性后MES的最大電流為34.09 mA。此結果表明還原氧化石墨烯改性MES可以提高陰極電流，這是因為泡沫銅電極經過改性后提高了比表面積，使得反應過程中電子的傳遞量增加，并且還原氧化石墨烯自身就具有導電性，因而MES的電流增大。無微生物對照組在外加電勢相同的情況下幾乎沒有產生電流。而系統中電流越大也就意味著陰極得到的激發態電子越多，陰極發生催化還原的反應越劇烈，越有利于電化學功能菌還原CO2生成有機物。

圖2 MES電流隨反應時間的變化

2.2.2 循環伏安曲線

MES的循環伏安曲線見圖3。由圖3可見：改性前MES和改性后MES與對照組相比，一個反應周期結束后的電流相應增加，表明實驗組具有生物膜的陰極的電化學活性較高；改性前MES的循環伏安曲線在-0.50 V左右處出現了一個還原峰，改性后MES的循環伏安曲線在-0.63 V附近處出現了還原峰，與對照組比對，可以排除是因為析氫反應造成的，由此確定該峰為CO2的還原峰；MES的循環伏安曲線為非對稱曲線，表明CO2還原過程是不可逆的。以上結果表明，采用微生物陰極構建的微生物電化學合成系統確實可以降低CO2還原的過電位。

圖3 MES的循環伏安曲線

2.2.3 電化學阻抗譜

改性前后生物陰極電極的電化學交流阻抗譜圖見圖4。

圖4 改性前后生物陰極電極的電化學交流阻抗譜圖

由圖4可見：電化學交流阻抗譜圖均由兩部分組成，一部分為半圓弧型的高頻區，另一部分為斜直線的低頻區；高頻區半圓弧曲線描述的是反應物在電極表面處發生氧化還原反應時的反應阻抗，圓弧直徑與MES系統的電荷轉移電阻成正比；低頻區的斜線表示反應底物在電極表面擴散時的擴散阻抗，影響擴散阻抗的主要因素是涂層材料的微觀結構，其斜線的長度與擴散阻抗呈正相關。

圖4的等效電路見圖5。根據圖5對生物陰極電極電化學交流阻抗譜的數據進行擬合，得到的擬合參數見表1。由表1可見，改性前生物陰極電極和改性后生物陰極電極的電荷轉移電阻分別為39.75 Ω和30.84 Ω，均高于對照組，表明生物陰極電極掛膜和改性后能顯著提高電子傳遞速率，從而提高產酸和產氣效果；另外，對比改性前后陰極電極的內阻發現，對照組的內阻為26.07 Ω，改性后生物陰極電極的內阻為44.06 Ω，表明陰極電極掛膜后和改性后提高了電極的內阻；而改性前生物陰極電極的內阻為62.09 Ω，對比改性前后內阻發現，改性后生物陰極電極的內阻更低，表明生物陰極改性可以降低系統生物陰極內阻。

圖5 生物陰極電極電化學交流阻抗譜的等效電路

表1 生物陰極電極電化學交流阻抗譜等效電路的擬合參數

2.3 MES的有機物產量

在外加陰極電勢為-0.8 V的條件下，改性前后MES的乙酸、丁酸產量和pH的變化見圖6。由圖6可見：在改性前MES的反應周期內，陰極室中第一天就能測到乙酸的生成，其質量濃度為57.0 mg/L；而丁酸的生成是在反應周期的第3天開始的，在第4天時質量濃度達到10.3 mg/L，反應進行到第10天時乙酸生成速率明顯減慢，乙酸和丁酸的積累量達到最大，質量濃度分別為246.0 mg/L和90.4 mg/L，這可能是由于隨著反應進行，部分乙酸通過鏈延長的方式轉化成了丁酸［17］，導致乙酸生成速率的下降；隨著乙酸、丁酸的積累，pH數值從7.1下降至6.3。

圖6 改性前后MES的乙酸、丁酸產量和pH的變化

由圖6還可見：在改性后MES的反應周期內，乙酸的積累量隨著反應的進行呈現出先上升后趨于平穩的趨勢，而丁酸的生成比改性前MES提前了1 d；pH隨著乙酸、丁酸的積累，數值從7.1下降至6.0，相比于改性前數值略微降低，原因主要是乙酸、丁酸產量相對增多；經過10 d的積累，乙酸的質量濃度最終達到265.0 mg/L，丁酸的質量濃度最終達到122.5 mg/L，相比于改性前分別增長了8%和35%。

2.4 電化學功能菌的DNA高通量測序

將MES反應前和反應10 d后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面微生物群落的DNA高通量測序結果與數據庫比較，在科水平上進行分類，得到還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物菌群結構，見圖7。

圖7 還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物菌群結構

由圖7可見：反應前電極表面的優勢菌種分屬于瘤球菌科（Ruminococcaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、乳酸細菌科（Lactobacillaceae）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）和芽孢桿菌科（Bacillaceae），相對豐度分別為28.97%、26.48%、12.37%、10.83%、10.19%和6.06%；反應后電極表面優勢菌種主要分屬于瘤球菌科和梭菌科［18-19］，其相對豐度分別為57.52%和34.69%；相對于反應前的優勢菌種，反應后電極表面瘤球菌科和梭菌科細菌的相對豐度分別提高0.98倍和0.31倍，其他菌種由于不適應環境而數量大幅減少。目前有較多文獻報道表明梭菌科細菌可以利用電子和質子還原CO2生成乙酸、丁酸，而瘤球菌科細菌的主要產物為乙酸［13，20］。通過DNA高通量測序進行菌群結構分析的結果可以發現，通過生物陰極外加電勢確實可以改善MES生物陰極表面生物膜上的菌群結構，篩選出能夠利用CO2的具有電化學活性的微生物。

3 結論

a）泡沫銅電極經還原氧化石墨烯改性后，三維空間網狀結構更有利于微生物的附著，同時表現出更好的電化學性能。改性后的陰極電極不僅能夠降低CO2還原的過電位，而且還具有更好的催化性能。

b）在外加陰極電勢為-0.8 V條件下，當反應進行到第10天時，改性前MES中乙酸和丁酸的積累量達到最大，質量濃度分別為246.0 mg/L和90.4 mg/L；改性后MES中乙酸和丁酸的最終質量濃度分別達到265.0 mg/L和122.5 mg/L，相比于改性前分別增長了8%和35%。

c）反應后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面瘤球菌科（Ruminococcaceae）和梭菌科（Clostridiaceae）細菌的相對豐度相比反應前分別提高0.98倍和0.31倍，其豐度分別為57.52%和34.69%。其他菌種由于不適應環境而數量大幅減少。