飼料中黃霉素A含量測定的研究進展

周迎春 華向美 劉少博

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黃霉素又稱富拉磷[1]、默諾霉素、斑伯霉素、黃磷脂素[2]或黃磷脂醇素、富樂霉素，它是一種多組分磷酸糖脂類抗生素，由灰綠鏈霉菌厭氧發酵產生[3-5]。黃霉素呈弱酸性，屬于強極性化合物，易溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺等小分子物質[6]；200 ℃開始分解[7]，在中性水和甲醇溶液中穩定[8]，紫外吸收峰為258 nm[9]。

現有研究表明，黃霉素有5種活性成分，皆具有類似的化學特性和抗菌活性[10-11]，黃霉素A 是黃霉素中最主要活性組分[12]，占活性組分總量60%～80%[13]，我國規定黃霉素A 的相對量應大于50%[14]。由于黃霉素5種活性成分結構相似且難以生產單一成分的標準品，因此，目前的研究中多通過檢測黃霉素A的含量來衡量黃霉素的含量。

1 黃霉素的應用及危害

黃霉素作為國外上市最早的一種抗生素飼料添加劑，它曾是國外唯一允許在養殖業中使用的含磷糖脂類抗生素。黃霉素用量少，卻對牛、豬、雞等動物促生長效果突出[15]，提高飼料利用效率[16]，可用于預防球蟲病[17]，抑制細菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、雙球菌、巴氏桿菌、布氏桿菌等[18-20]，與其他藥物添加劑如維生素、氨基酸、微量元素等無配伍禁忌[21]。黃霉素具有的顯著優勢使其被廣泛用于畜禽和水產養殖中。

在美國，黃霉素被批準用于牛、豬和家禽，但使用水平應在0.5～20 mg/kg，可以單獨使用，也可以與莫能菌素、拉沙里菌素或鹽霉素等離子載體抗生素聯合使用，以提高增重率和飼料效率[22]。2002年我國原農業部正式批準黃霉素預混劑為新獸藥，并在同年引進外國先進的黃霉素生產工藝技術進行大規模生產[23]。黃霉素以及所有與其有關的產品已被廣泛使用在我國畜禽水產養殖中來提高動物的生長繁殖性能[24]。2005年歐盟農業部長會議決定，自2006年1月1日起，禁止在飼料中添加黃霉素[25]，2009年9月30日起黃霉素僅允許用于兔子飼養過程中[1]。

研究表明，黃霉素可引起瘤胃細菌的適應性反應，從而顯著改變其抗生素敏感性[26]。黃霉素本身無抗原性，與其他常用的抗生素之間有無交叉抗原性有待深入研究。作為非代謝類藥物，黃霉素經口服后幾乎不被吸收，一方面可能在動物產品中殘留[27]，另一方面通過動物糞便會不可避免地排到環境中，容易污染土壤、地表水等環境[28]，進而可能給人類安全帶來威脅。長期食用黃霉素殘留的動物源食品會破壞人體腸道菌群[29]；對動物的骨骼發育有影響，大量攝入甚至會產生造血功能障礙[30]，其對動物及人體的其他危害還有待于深入研究[15]。

2016年8月，國家衛生計生委等十四部委聯合發布《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016-2020年）》，黃霉素作為一種抗菌藥物，不可例外地受到風險評估[31]。檢驗檢疫部門也將黃霉素列為飼料和動物源性食品殘留監控計劃[32]。農業農村部第194號公告指出[33]，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，這其中就包含禁用黃霉素預混劑。對飼料中黃霉素A 的含量進行檢測是實現源頭治理的關鍵，因此有必要深入了解黃霉素A測定方法的研究進展。

2 黃霉素A 檢測技術研究進展及存在的問題

目前針對黃霉素檢測技術的研究主要是對其主要活性組分黃霉素A 的測定，一般通過檢測黃霉素A 的含量間接計算樣品中黃霉素的添加量。檢測技術主要有液相色譜法[34]、液相色譜-串聯質譜法[30]、離子對高效液相色譜法[35]，測定對象多為飼料，個別為豬肉、禽類組織。

2.1 液相色譜法檢測進展及存在問題

2003年楊秀玉等[9]利用液相色譜法對規格為4%和8%的黃霉素預混劑及各生產廠家提供的標準品中黃霉素A 的相對量進行了檢測。試驗利用YMC-Pack ODS-A S 色譜柱、乙腈＋甲酸銨溶液(45＋55)等度洗脫對黃霉素5種活性組分進行分離，采用高效液相色譜儀，在258 nm 檢測波長下，用紫外檢測器進行檢測，最后利用歸一化法計算黃霉素A的相對量。該方法操作簡便、快速，但定量結果與外標法相比，誤差較大。

我國2006年版《進口獸藥質量標準》[36]指出，可通過液相色譜法來檢測黃霉素預混劑中黃霉素A含量。該測定方法與2003年楊秀玉等[9]研究方法相似，采用歸一化法定量，與外標法相比，不能很好地反映黃霉素A實際含量。

江蘇省實施的地方標準《DB32/T 1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測定高效液相色譜法》[37]中指出：飼料和飼料添加劑中黃霉素A 經甲醇水提取，中性氧化鋁柱凈化，乙腈＋甲酸銨溶液(45＋55)等度洗脫，C18 色譜柱分離，紫外檢測器258 nm 波長測定，采用外標法定量，可使飼料和飼料添加劑方法檢出限達到1 000μg/kg。

2010年，李會榮等[38]建立了利用高效液相色譜儀測定飼料中黃霉素A含量的方法。稱5 g飼料，樣品中的黃霉素經甲醇甲酸銨2 次提取，用C18 小柱凈化除雜，其他條件與阮靜等[7]檢測方法一致，黃霉素A 方法定量限為1.5 mg/kg，黃霉素添加濃度為2、3、5 mg/kg 時，黃霉素A 的回收率在88.5%～113.2%，變異系數在2.2%～5.1%。 與《DB32/T 1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測定高效液相色譜法》相比，該方法定量限較高，且以黃霉素標準品換算成相當于黃霉素A 的質量來配制標準曲線，加之黃霉素各組分分離度較差，必然會增大實驗誤差，不利于準確定性、定量。

安徽省實施的地方標準《DB34/T 1358-2011 飼料中黃霉素的測定-高效液相色譜法》[39]中指出：飼料中黃霉素經50%的甲醇提取后，用pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度，上機條件與江蘇省《DB32/T1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測定高效液相色譜法》一致，該方法中黃霉素5種組分得到很好的分離，峰型好，方法檢出限為500μg/kg，有效提高了檢測的靈敏度。

2008年，曾兆國等[35]在流動相中加入庚烷基磺酸鈉離子對試劑，利用液相色譜儀分離鑒別黃霉素。試驗采用C18 色譜柱，以乙腈-3%庚烷基磺酸鈉水溶液(35 : 65)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器檢測波長256 nm。黃霉素是一種弱酸性的多組分的物質，庚烷基磺酸鈉是一種離子對試劑，它在水中可電解成庚烷磺酸鈉負離子，與胺類電離成的銨正離子結合而改變其保留性質，因此，本試驗中建立的檢測方法可使黃霉素5 種主要組分完全有效分離，而且無其他雜峰干擾，但具體運用到實際樣品的檢測，仍需要建立前處理方法以滿足上機測定條件。

液相色譜法實驗條件操控起來相對較容易，但它單純利用極性進行分離測定，很難將黃霉素A 從相似的組分中有效分離出來且方法檢出限、定量限往往偏高，難以滿足檢測需要。黃霉素成分的復雜性、結構的相似性讓超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜技術成為黃霉素A檢測的首選方法。

2.2 液相色譜-串聯質譜法研究進展及存在問題

2007年，Sandra[34]利用液相色譜-單四級桿串聯質譜儀對雞糞中黃霉素通過C4 SPE 小柱，50 ℃甲醇洗脫，C18 柱，0.3 %的甲酸水+乙腈作為流動相，測定黃霉素A。確定黃霉素A 兩個母離子[M–H]-1 580.6 m/z 和[M–H]2-789.8 m/z，根據兩個母離子的峰面積繪制50-5 000μg/L范圍內的曲線圖，研究表明必須通過基質曲線定量，否則結果嚴重不準確。該研究為后來學者利用液相色譜-串聯質譜法測定黃霉素A 提供了思路，但是由于液相色譜-單四級桿串聯質譜儀不能利用二級質譜定性，容易引起檢測結果不準確。

2010年，Gallo 等[1]建立了測定飼料中黃霉素A含量的方法。樣品中的黃霉素A 經氨水甲醇提取，旋轉蒸發至近干除去有機相后復溶，經HLB 柱凈化，采用液相色譜-串聯質譜儀，以Synergi MAX RP色譜柱為分析柱，乙腈+10 mmol/L 的乙酸銨為流動相進行梯度洗脫，多反應監測（MRM）、負離子模式下檢測。以單荷電分子離子和雙荷電分子離子作為母離子（[M–H]-1 580.4 m/z 和[M–H]2-789.9 m/z），從中篩選出4 個主要子離子產物（詳見圖1），[M–H]2-中575.7 m/z(定量離子)、554 m/z 以及[M–H]-中1 152 m/z，1 109 m/z 定性離子，利用飼料基質配制標準曲線，對飼料中黃霉素A 進行了分析。方法的檢出限為30 μg/kg，方法的定量限為100 μg/kg，平均回收率83.9%～94.2%，相對標準偏差RSD＜23%。相比液相色譜法，該方法特異性強，但需要配置基質校準曲線，增加了操作的復雜性。

圖1 負離子模式下黃霉素A可能存在離子碎片

2012年，李金強等[32]也對液相色譜-串聯質譜法測定飼料中黃霉素A 含量進行了研究，試驗選用Agilent Ecillps C18 色譜柱為分析柱，選擇［MH］2－789 m/z 為母離子，其子離子分別為575.7 m/z(定量離子)和553.8 m/z(定性離子)，經液相色譜-串聯四級桿質譜檢測。黃霉素A 的線性范圍為100～5 000 μg/L，相關系數(r)為0.999 725。方法的檢出限為30 μg/kg，方法的定量限為100 μg/kg，回收率在75%～95%，相對標準偏差在4.7%～6.4%。該方法特異性強，且該方法不需要配置基質校準曲線，操作簡便，利于推廣應用。

2016年，吳家鑫等[40]利用超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間串聯質譜儀對預混劑中的黃霉素5種組分進行鑒別分析。黃霉素預混劑樣品加入適量50%甲醇溶液，混勻，置超聲浴中超聲15 min，放冷至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至適當濃度，搖勻，過濾后上機。采用C18 色譜柱分離樣液中的5 種黃霉素組分，以乙腈-0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L 乙酸銨)為流動相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，質譜條件為電噴霧離子源，檢測方式為負離子全掃描模式，通過保留時間、精確分子質量和二級質譜特征碎片完成對黃霉素的5種組分的鑒別。與高效液相色譜方法比較，本方法具有判斷準確、鑒別快速的特點，但用于檢測時仍需要建立相應的前處理方法。

3 展 望

飼料中黃霉素A 含量測定的研究有了一定的基礎，但其檢測技術和監控體系仍相對滯后。由于黃霉素A 的純品難以獲得，試驗方法多以黃霉素為標準品，測定結果通過含量換算來計算黃霉素A 含量，加大了檢測誤差，多數前處理中提取液需要旋蒸近干復溶后才能進行凈化，整個流程過于復雜，不利于大批量快速檢驗檢測。因此，盡快制得黃霉素A 標準品，優化前處理方法，建立準確、高效的檢測黃霉素A含量的方法勢在必行。