過氧化氫誘導(dǎo)大鼠離體子宮韌帶成纖維細(xì)胞的相關(guān)變化

卓然然,聶明朝,李麗紅,李常虹,張芳芳

(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心(海南省婦幼保健院)婦產(chǎn)科,海口 571100)

盆底功能障礙性疾病是中老年女性的常見病,主要是由于損傷、衰老等原因?qū)е屡璧捉M織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,最終發(fā)生盆腔器官位置異常及相應(yīng)器官功能障礙,是影響女性身心健康和生活質(zhì)量的一個(gè)重要公共問題[1-2]。該病包括盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)和壓力性尿失禁。女性盆腔器官和盆底組織處于妊娠、分娩等引起腹內(nèi)壓力變化的復(fù)雜生物力學(xué)環(huán)境中,容易損傷盆底肌肉筋膜及子宮韌帶,或因其他原因?qū)е缕鋸埩p低,支持功能薄弱,使腔內(nèi)器官下降移位,即為盆底器官脫垂[3-4]。有研究顯示,POP的發(fā)生還與氧化應(yīng)激相關(guān)[5],Kim等[6]對(duì)盆底組織基因組多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激相關(guān)基因與POP相關(guān)。

成纖維細(xì)胞是子宮韌帶的主要細(xì)胞,也是盆底韌帶的主要受力細(xì)胞,主要功能是合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)等,以此促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝,支持組織結(jié)構(gòu)和功能[7],其中Ⅰ型膠原與支持作用有關(guān),硬度較大,直徑較粗,Ⅲ型膠原、彈性蛋白與組織的彈性有關(guān),這些成分的變化導(dǎo)致彈性和拉伸強(qiáng)度降低,導(dǎo)致韌帶、筋膜等支持結(jié)構(gòu)松弛[8-9]。正常機(jī)體存在抗氧化系統(tǒng),當(dāng)活性氧生成過量和(或)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)受損導(dǎo)致活性氧及其代謝產(chǎn)物過量聚集時(shí),氧化還原平衡失調(diào),大量的活性氧簇就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。過氧化氫是活性氧簇的主要成員之一,可通過多種途徑損害細(xì)胞,是一種比較常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞老化誘導(dǎo)劑[10-11]。本研究以子宮韌帶成纖維細(xì)胞為干預(yù)對(duì)象,用不同濃度過氧化氫刺激模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境,觀察氧化應(yīng)激對(duì)大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、膠原合成以及炎癥因子表達(dá)的影響并探討其相關(guān)分子機(jī)制,為POP疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡雌性SD大鼠4只,SPF級(jí),體重70~80 g,購買于湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于海南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(瓊)2019-0011],所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行并經(jīng)海南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HNWCMC倫審2019年第[7]號(hào)),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

過氧化氫(H2O2)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、膠原酶(Gibco,美國);4%多聚甲醛、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國);MTT試劑、二甲基亞砜(上海碧云天生物有限公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);波形蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體、生物素化山羊抗大鼠IgG、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(武漢博士德生物工程有限公司);細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量檢測試劑盒(Sigma公司,美國);抗Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、p-ERK1/2、ERK1/2、Akt、p-Akt、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗(Santa Cruz Biotechnology公司,美國)。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Therm Fisher公司,美國);倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國);流式細(xì)胞儀(BD公司,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 子宮韌帶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

將4周齡雌性SD大鼠頸椎脫臼處死后,無菌條件下取出雙側(cè)子宮韌帶組織,PBS清洗3~5遍,用剪刀剪成1 mm×1 mm左右的小塊,用含0.25%胰蛋白酶及0.2%Ⅱ型膠原酶的混合液消化2 h,體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清終止消化,1500 r/min離心洗滌5 min,棄上清,用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2 d換液1次,待細(xì)胞生長達(dá)到80%~90%時(shí)按1∶2比例進(jìn)行傳代,取第3~5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 成纖維細(xì)胞鑒定

選取生長狀況良好的第3~5代子宮韌帶成纖維細(xì)胞,制成每毫升2×105個(gè)的細(xì)胞懸液,以每孔1 mL接種于預(yù)先放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,倒置顯微鏡下觀察蓋玻片上的細(xì)胞增殖至70%~80%時(shí)進(jìn)行檢測。取出玻片,PBS漂洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗3次×3 min;體積分?jǐn)?shù)為3%H2O2孵育15 min,PBS漂洗3次×3 min;10%山羊血清封閉20 min,消除非特異性背景,吸去多余液體,不必清洗;加入抗角蛋白、抗波形蛋白單克隆抗體,4℃孵育過夜,PBS漂洗3次×3 min;滴加生物素化山羊抗大鼠IgG二抗室溫孵育20 min,PBS漂洗3次×3 min;然后加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物室溫孵育20 min,PBS漂洗3次×5 min;DAB顯色,顯微鏡下掌握染色程度,流水沖洗;蘇木精復(fù)染1 min,自來水沖洗返藍(lán),鏡下觀察。

1.3.3 過氧化氫誘導(dǎo)子宮韌帶成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立

據(jù)前期參考文獻(xiàn)[12],選擇0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞干預(yù)4 h,建立細(xì)胞低水平和高水平的氧化應(yīng)激模型,以正常培養(yǎng)未進(jìn)行任何干預(yù)的子宮韌帶成纖維細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

將第3代子宮韌帶成纖維細(xì)胞懸液以每孔2×105個(gè)的密度接種于96孔板,每孔100μL,細(xì)胞分3組:低氧化應(yīng)激組用0.2 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h,高氧化應(yīng)激組用0.8 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h,對(duì)照組單純采用DMEM完全培養(yǎng)基孵育4 h,然后每孔加入10μL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清,每孔加150μL DMSO溶液,振蕩10 min,使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況

將第3代子宮韌帶成纖維細(xì)胞懸液以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后細(xì)胞分3組:低氧化應(yīng)激組用0.2 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h,高氧化應(yīng)激組用0.8 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h,對(duì)照組單純采用DMEM完全培養(yǎng)基孵育4 h,PBS洗滌2次,0.25%胰酶消化,離心收集細(xì)胞,加入500μL Binding Buffer結(jié)合緩沖液吹打混勻,然后依次加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,室溫避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.3.6 Western blot檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、炎癥因子、信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

按上述分組干預(yù)4 h后收集細(xì)胞,PBS清洗2次,按比例加入細(xì)胞裂解液,研磨細(xì)胞,12000 r/min離心8 min,提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA方法檢測蛋白濃度。取20μL蛋白樣品,加入適量濃縮的蛋白上樣緩沖液混合,100℃水浴中煮沸5 min使蛋白變性,冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到加樣孔內(nèi),100 V電壓下SDS-PAGE凝膠電泳分離90 min;然后將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在100 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h;取出PVDF膜,用含5%脫脂奶粉封閉液放搖床上封閉1~3 h;加入一抗(抗Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt、Akt、GAPDH抗體)室溫孵育1 h后,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗室溫孵育2 h,TBST清洗3次,加入ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min,曝光,顯影,用Image J軟件分析各組目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢測水平為α=0.05,樣本均數(shù)多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 子宮韌帶成纖維細(xì)胞形態(tài)及鑒定結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)以梭形、紡錘形為主,胞體狹長,胞核呈橢圓形,胞漿豐富,細(xì)胞排列有一定的方向性。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:波形蛋白染色陽性,胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒,角蛋白染色陰性,符合成纖維細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記特征。見圖1。

圖1 子宮韌帶成纖維細(xì)胞形態(tài)及鑒定結(jié)果Note.A,Fibroblasts of the third generation of uterine ligament were long spindle shaped.B,Immunocytochemical staining showed that vimentin staining was positive.C,Keratin staining was negative.Figure 1 Morphology and identification results of fibroblasts from uterine ligament

2.2 氧化應(yīng)激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力,高氧化應(yīng)激組吸光度值顯著低于低氧化應(yīng)激組、對(duì)照組,差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h后,細(xì)胞增殖能力下降,而低氧化應(yīng)激組吸光度值與對(duì)照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 氧化應(yīng)激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞增殖的影響Note.Compared with the control group and low oxidative stress group,*P＜0.05.The same as below.Figure 2 Effect of oxidative stress on proliferation of fibroblasts from uterine ligament

2.3 氧化應(yīng)激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測高氧化應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率[(39.6±4.4)%]顯著高于低氧化應(yīng)激組、對(duì)照組[(18.45±1.61)%,(12.12±1.06)%],差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h后,細(xì)胞凋亡率明顯增高,而低氧化應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮韌帶成纖維細(xì)胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of fibroblasts in uterine ligament

2.4 氧化應(yīng)激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

Western blot檢測高氧化應(yīng)激組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著低于低氧化應(yīng)激組、對(duì)照組,差異有顯著性意義(P＜0.05),可見0.8 mmol/L過氧化氫干預(yù)4 h后,Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原合成明顯減少,而低氧化應(yīng)激組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)Figure 4 Western blot was used to detect the expression of type I collagen and type III collagen in uterine ligament fibroblasts

2.5 氧化應(yīng)激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測高氧化應(yīng)激組白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的蛋白表達(dá)水平明顯高于低氧化應(yīng)激組、對(duì)照組,差異有顯著性意義(P＜0.05);同時(shí)低氧化應(yīng)激組白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的蛋白表達(dá)水平也輕微提高,但與對(duì)照組比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細(xì)胞炎癥因子蛋白的表達(dá)Figure 5 Western blot was used to detect the expression of inflammatory factor protein in fibroblasts of uterine ligament

2.6 Western blot檢測通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用Western blot檢測MEK-ERK1/2與PI3KAkt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組和低氧化應(yīng)激組相比,高氧化應(yīng)激組p-ERK1/2、p-Akt的表達(dá)明顯降低(P＜0.05),而總蛋白ERK1/2、Akt的表達(dá)基本保持不變。見圖6。

圖6 Western blot檢測各組子宮韌帶成纖維細(xì)胞通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 6 Western blot was used to detect the expression of fibroblast pathway related proteins in each group

3 討論

POP是一類由盆底支持結(jié)構(gòu)功能障礙而引起的盆腔正常器官(陰道壁、子宮、膀胱、直腸等)位置下移,從而嚴(yán)重影響人們的身體健康及生活質(zhì)量的常見疾病。年齡、陰道分娩、慢性便秘、肥胖和激素水平下降是公認(rèn)的危險(xiǎn)因素,隨著年齡的增長,分娩的影響逐漸降低,而衰老、激素水平改變的影響則明顯增加[13-14]。根據(jù)衰老自由基理論[15],細(xì)胞衰老在某種意義上是氧化損傷的結(jié)果。研究顯示導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的活性氧不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,還能激活細(xì)胞使其具有表型轉(zhuǎn)化的潛能[16-17]。過氧化氫是活性氧的一種,也是體內(nèi)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的主要效應(yīng)分子,其參與調(diào)節(jié)新陳代謝、老年性疾病、凋亡和生長因子相關(guān)的信號(hào)通路,盡管其本身會(huì)迅速與信號(hào)分子反應(yīng)而失活,但其造成級(jí)聯(lián)反應(yīng)能導(dǎo)致氧化應(yīng)激持續(xù)存在,使其成為氧化應(yīng)激研究的重要工具藥[18]。過氧化氫介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在POP疾病進(jìn)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。課題組前期用不同濃度過氧化氫干預(yù)后發(fā)現(xiàn)子宮旁韌帶成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高,使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),且具有一定的劑量依賴性,認(rèn)為0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫可導(dǎo)致細(xì)胞低水平氧化應(yīng)激和高水平氧化應(yīng)激[12]。在此基礎(chǔ)上,該實(shí)驗(yàn)選取0.2 mmol/L和0.8 mmol/L過氧化氫誘導(dǎo)大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生,初步觀察不同程度氧化應(yīng)激作用下大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、膠原合成以及炎癥因子表達(dá)并探討其相關(guān)分子機(jī)制。本研究采用MTT法和Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞增殖、凋亡情況,結(jié)果顯示:低水平氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)活性氧雖有增多,細(xì)胞活力有所下降,細(xì)胞凋亡有所增加,但與對(duì)照組比較差異無顯著性意義,說明其不足以影響細(xì)胞發(fā)揮正常功能;但隨著活性氧產(chǎn)生繼續(xù)增加,細(xì)胞氧化應(yīng)激水平也增加,細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加,與對(duì)照組和低氧化應(yīng)激組比較差異有顯著性意義,說明高濃度的過氧化氫能明顯抑制子宮韌帶成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

以往研究表明,以膠原合成減少為特征的細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂是POP的病理分子基礎(chǔ)[19]。膠原蛋白是一組由多種糖分子組成的大家族,是細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。不同類型的膠原蛋白有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu),相應(yīng)的具有不同功能和免疫學(xué)特性。盆底的筋膜和韌帶膠原蛋白主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成,Ⅰ型膠原蛋白直徑較粗,有很高的抗張強(qiáng)度,對(duì)盆腔器官起支持作用;Ⅲ型膠原蛋白直徑較細(xì),與彈性有關(guān)。Jackson等[20]發(fā)現(xiàn)POP患者陰道組織膠原含量減少20%;Lang等[21]報(bào)道壓力性尿失禁和POP患者子宮韌帶膠原纖維直徑明顯大于對(duì)照組,這些韌帶彈性較小,更容易斷裂,以膠原降解占主導(dǎo)作用可能是發(fā)生壓力性尿失禁和POP的原因之一;Han等[22]研究發(fā)現(xiàn)POP伴或不伴壓力性尿失禁患者子宮韌帶Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組;Vulic等[23]研究發(fā)現(xiàn)POP患者子宮骶韌帶中基質(zhì)金屬蛋白酶1表達(dá)增加,Ⅰ型膠原表達(dá)降低,并認(rèn)為子宮骶韌帶中Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶1的表達(dá)可能與POP有關(guān)。本研究結(jié)果顯示外源性過氧化氫孵育4 h后,較低濃度的過氧化氫刺激對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞膠原合成代謝與對(duì)照組無顯著差異,而高濃度的過氧化氫促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原的分解代謝。因此,我們認(rèn)為氧化應(yīng)激是導(dǎo)致子宮韌帶成纖維細(xì)胞膠原代謝紊亂的原因之一。Western blot檢測實(shí)驗(yàn)可知,高氧化應(yīng)激組白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的蛋白表達(dá)水平明顯高于低氧化應(yīng)激組、對(duì)照組;同時(shí)低氧化應(yīng)激組也輕微提高白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的蛋白表達(dá)水平,但與對(duì)照組比較無顯著差異,說明這些炎性因子參與了過氧化氫誘導(dǎo)的子宮韌帶組織炎癥反應(yīng)。

目前研究較廣泛的與細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)生過程相關(guān)的信號(hào)通路分子主要有MEK-ERK1/2與PI3KAkt信號(hào)通路等[24-26]。ERK1/2是MAPK通路中極其重要的組成部分之一,研究表明,ERK活化后通過促進(jìn)Cyclin D1表達(dá)以及其與CDK4結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展,促進(jìn)細(xì)胞增殖分化。ERK持續(xù)激活可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生,抑制ERK的活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27]。PI3K是生長因子受體下游直接的信號(hào)傳遞分子,負(fù)責(zé)傳遞細(xì)胞內(nèi)有絲分裂信號(hào),對(duì)細(xì)胞的生存、增殖起重要作用[28-29]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),對(duì)大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行低、高濃度過氧化氫干預(yù)4 h后,有效抑制MAPK-ERK1/2、PI3K-Akt信號(hào)通路的活化,與對(duì)照組和低氧化應(yīng)激組相比,高氧化應(yīng)激組p-ERK1/2、p-Akt的表達(dá)明顯降低(P＜0.05),而總蛋白ERK1/2、Akt的表達(dá)基本保持不變,上述指標(biāo)在對(duì)照組和低氧化應(yīng)激組無顯著差異。這些結(jié)果表明高濃度過氧化氫通過磷酸化ERK1/2和Akt,抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。總之,高濃度過氧化氫通過抑制ERK1/2信號(hào)通路,下調(diào)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá),抑制子宮韌帶成纖維細(xì)胞的增殖,研究表明參與盆腔功能障礙性疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制十復(fù)雜且涉及的信號(hào)通路不止一種[30-32],各個(gè)通路共同參與了盆腔功能障礙性疾病的發(fā)展,為解釋盆腔功能障礙性疾病的相關(guān)作用機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述,氧化應(yīng)激微環(huán)境中較高濃度的過氧化氫通過抑制MAPK通路中ERK1/2表達(dá)和PI3KAkt通路中Akt表達(dá),引起子宮韌帶成纖維細(xì)胞的增殖能力下降,細(xì)胞凋亡增加,膠原合成受阻。另外,氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)增加,對(duì)子宮韌帶成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡有一定影響,并進(jìn)一步影響膠原合成,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。