雙陰性T淋巴細胞在兒童腺病毒肺炎患兒中的變化及意義探討①

李權恒 董偉然 李金英 高文杰 徐麗娟 張中馥 張麗君

（河北省兒童醫院急診科，石家莊050031）

腺病毒是兒童肺炎常見病原，近1/3 可發展為重癥腺病毒肺炎，甚至引起呼吸窘迫綜合征而導致死亡，并可遺留不同程度的后遺癥，嚴重影響兒童的生活［1］。重癥腺病毒發生除與病毒表型和載量有關外，病毒感染后免疫功能紊亂和機體免疫功能低下也可導致其發生、發展［2］。雙陰性T 淋巴細胞（double negative T cell，DNT）是一特殊類型T 淋巴細胞，具有一定的抑制性免疫調節作用，參與自身免疫性疾病、腫瘤性疾病以及移植排斥反應的發生發展過程［3-6］。為探討DNT 在腺病毒肺炎中的變化以及與患兒病情嚴重程度的關系，本文對癥腺病毒肺炎患兒外周血淋巴細胞亞群的水平進行分析，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 資料 選擇 2016 年 1 月至 2019 年 12 月在河北省兒童醫院呼吸一科住院診斷為腺病毒肺炎患兒為研究對象，病例納入標準：①腺病毒肺炎診斷標準：根據臨床表現及胸部影像學診斷為肺炎的患兒，并鼻咽部分泌物或痰腺病毒DNA 陽性。根據病情嚴重程度分為輕癥腺病毒肺炎、重癥腺病毒肺炎兩組，病情嚴重程度參照2019 年國家衛生健康委制定的《兒童社區獲得性肺炎診療規范》［7］；②年齡1 月~6 歲，性別不限；③近兩周之內無嚴重感染性疾病、未使用過糖皮質激素類藥物；④無免疫缺陷病史、自身免疫性疾病、先天性心臟病、血液系統疾病及其他嚴重基礎疾病者；⑤臨床資料完善。共入組312 例，其中輕癥腺病毒肺炎患兒197 例，重癥腺病毒肺炎患兒115例。并選同期在保健科進行健康體檢的60 例兒童作為健康對照組，其中男41 例，女19 例。本研究經我院倫理委員會批準，家屬知情同意。

1.2 方法 所有患兒及正常對照組兒童均由護士取得血樣后送檢，送檢后8 h 內由我院兒研所專門醫師應用美國貝克曼庫爾特公司FC500型流式細胞儀嚴格按操作手冊及試劑盒說明書對患兒外周血淋巴細胞亞群百分比，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3+CD4?CD8?、CD3+CD4+CD8+、CD19+、CD56+進行檢測，并記錄。正常參考范圍：CD3+∶60%~82%；CD4+∶35%~58%；CD8+∶20%~35%；CD4+/CD8+∶0.7%~2.5%；CD3+CD4?CD8?（DNT）∶<6.7%；CD3+CD4+CD8+∶<2.0%；CD19+∶5%~18%；CD56+∶4%~18%。

1.3 統計學方法 應用SPSS26.0軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以表示，組間采用重復測量方差分析，非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗，計數資料采用n表示，組間比較采用卡方檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較 共入組腺病毒肺炎患兒312例，男 202 例，女 110 例，平均年齡 16.5（11，35）月齡，輕癥腺病毒肺炎患兒共197 例，其中男125 例，女72例，平均年齡17（11，39）月齡，重癥腺病毒肺炎共115例，其中男77例，女38例，平均年齡16（11.5，36）月齡，正常對照組兒童60 例，其中男41 例，女19例，平均年齡21.5（15，36）月齡。三組的年齡、性別比較差異無統計學意義（P>0.05）。對腺病毒肺炎患兒進行年齡分層，輕癥腺病毒肺炎組和重癥腺病毒肺炎組各年齡段性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組腺病毒肺炎患兒年齡分層比較［M（P25，P75）］Tab.1 Comparison of age stratification between two groups of children with adenovirus pneumonia［M（P25，P75）］

2.2 不同組間外周血T 淋巴細胞亞群水平比較 見表2，三組比較CD3+、CD4+、DNT、CD3+CD4+CD8+、CD19+百分比差異有統計學意義（P<0.01），其余指標差異無統計學意義（P<0.01）；與正常對照組相比輕癥腺病毒肺炎組和重癥腺病毒肺炎組CD3+、CD4+、DNT 百分比下降，重癥腺病毒肺炎組下降更顯著（P<0.05）；CD19+百分比在正常對照組與重癥腺病毒肺炎組及輕癥與重癥腺病毒肺炎組比較差異有統計學意義（P<0.05），而正常對照組組與輕癥腺病毒肺炎組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 不同組間外周血T淋巴細胞亞群水平比較［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

表2 不同組間外周血T淋巴細胞亞群水平比較［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

Note：Compared with normal control group，1）P<0.05；Compared with severe adenovirus group，2）P<0.05.

CD3+68.73±6.0438.53±6.48 Normal control（n=60）Mild adenovirus pneumonia（n=197）Severe adenovirus pneumonia（n=115）Z/ F P 22.73±5.24 22.52±6.50 64.20（56.40，69.30）1）2）34.90±9.301）2）21.40（17.40，26.00）1.60（1.40，2.20）1.60（1.20，2.10）7.10（4.80，8.40）4.30（2.90，6.00）1）2）0.10（0.00，0.10）0.10（0.10，0.20）1）24.60（17.90，31.00）5.80（3.40，8.30）6.20（3.60，9.80）6.50（3.70，9.50）1.017 0.601 58.74±12.301）31.81±10.281）27.91±11.71）34.283 0.000 19.043 0.000 20.70（16.50，25.40）2.111 0.348 1.60（1.00，2.00）4.633 0.099 3.50（2.40，5.00）1）53.877 0.000 0.10（0.00，0.20）1）18.253 0.000 9.938 0.007 CD4+Groups CD8+CD19+CD4+/ CD8+CD3+CD4?CD8?CD3+CD4+CD8+CD56+

2.3 腺病毒肺炎患兒外周血T 淋巴細胞亞群按年齡分層比較 0~1 歲和3~6 歲輕癥、重癥腺病毒肺炎患兒外周血總淋巴細胞亞群各指標比較差異均無統計學意義（P>0.05），在1~3 歲年齡段重癥腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+、DNT 水平低于輕癥腺病毒肺炎組，CD19+高于輕癥腺病毒肺炎組，差異均有統計學意義（P<0.05），其余指標比較差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 腺病毒肺炎患兒外周血T淋巴細胞亞群年齡分層結果比較［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil?dren［，M（P25，P75）%］

表3 腺病毒肺炎患兒外周血T淋巴細胞亞群年齡分層結果比較［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil?dren［，M（P25，P75）%］

Age（Years）Groups CD3+CD4+CD8+CD4+/ CD8+CD3+CD4?CD8?CD3+CD4+CD8+CD19+CD56+33.32±11.26 59.88±11.7918.90（15.80，23.50）1.90（1.30，2.70）2.70（1.95，3.45）0.10（0.00，0.20）23.70±10.736.30（3.10，10.70）0~159.44±13.3133.23±11.6920.70（16.40，24.50）1.60（1.30，2.00）3.00（2.20，4.40）0.10（0.00，0.20）27.69±12.636.70（4.50，10.50）1.476 0.143 0.157 0.875?1.484 0.138?1.500 0.134 Mild adenovirus pneumonia（n=69）Severe adenovirus pneumonia（n=44）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=98）Severe adenovirus pneumonia（n=54）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=30）Severe adenovirus pneumonia（n=17）Z/ F P?1.440 0.15?0.853 0.394?0.064 0.949?0.380 0.704 62.50（55.50，67.80）34.50±8.2221.61±5.771.60（1.20，2.00）5.20（3.60，6.20）0.10（0.10，0.20）25.70（19.50，30.92）6.25（3.77，9.85）1~354.20±10.1329.40±8.7919.60（16.10，25.70）1.60（0.90，2.10）4.95（3.62，6.20）0.10（0.00，0.20）31.34±10.825.40（2.30，8.00）?4.304 0.000 3.578 0.000?0.755 0.45?1.488 0.137?5.497 0.000?1.443 0.149?3.665 0.000?1.675 0.094 67.60（63.10，73.30）34.04±8.4325.10（20.52，28.60）1.40（1.00，1.70）5.65（4.32，7.50）0.10（0.00，0.20）20.10（15.47，25.67）5.35（3.47，9.70）3~667.03±10.3134.47±9.9322.40（17.67，36.90）1.50（1.12，1.90）6.18±3.530.10（0.07，0.30）21.11±8.837.30（3.77，9.37）?0.188 0.851?0.210 0.838?0.856 0.392?0.632 0.527?0.370 0.714?0.166 0.869?0.188 0.851?0.470 0.638

3 討論

腺病毒是兒童呼吸道感染常見病原，其導致的兒童重癥肺炎占兒童重癥肺炎20%以上，在進行機械通氣的兒童重癥肺炎患兒中，腺病毒亦是檢出最多的病毒病原，其易造成2 歲以下嬰幼兒及存在免疫功能障礙患者的死亡，腺病毒感染后可引起T、B細胞數量及功能的降低，造成Th1/Th2比例失衡，引起機體免疫功能紊亂［8-11］。T 淋巴細胞是參與細胞免疫的主要細胞，按T細胞抗原受體表達不同，分為CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞兩個亞群，CD3+是T細胞激活的標志物，CD4+是T 細胞應答功能的標志物，CD8+是對非己抗原誘發免疫應答抑制作用的標志物，正常情況下這兩種淋巴細胞亞群之間相互協調、相互平衡，使機體處于免疫穩定狀態，當機體免疫系統受抗原刺激后，CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+降低說明T 細胞對外來入侵的抑制功能降低［12-14］。B 淋巴細胞是體液免疫效應細胞，CDl9+細胞為活化B 細胞，可分泌多種免疫球蛋白和抗體，介導機體的免疫應答，外周血中CD19+分子的表達高低可代表B淋巴細胞水平。

研究表明呼吸道感染患兒CD3+、CD4+水平下降，CD19+水平升高，且隨病情加重，CD3+、CD4+水平下降以及CD19+水平偏移越明顯［15-16］。呼吸道病毒感染T淋巴細胞改變程度大于細菌感染［17］。腺病毒感染時CD3+、CD4+、CD19+改變程度大于呼吸道合胞病毒，且與病情嚴重程度有關［18-20］。本研究也發現腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+低于正常對照兒童，且重癥腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+降低程度大于輕癥腺病毒肺炎患兒，提示腺病毒感染可導致機體細胞免疫功能受損，病情越重損傷程度越明顯，且CD19+兩組患兒均高于正常值，重癥腺病毒肺炎升高更明顯，分析考慮與重癥腺病毒肺炎細胞免疫功能受損、B 淋巴細胞依賴的T細胞功能受損、B 淋巴細胞產生抗體功能不足有關，造成機體免疫失衡，所以對于重癥腺病毒肺炎患兒適當給予免疫調節劑，有助于患兒免疫狀態的改善，從而提高治療效果。

DNT 是T 淋巴細胞的一個獨特亞群，既不表達CD4+也不表達CD8+，其在體內調節免疫的作用機制十分復雜，研究發現DNT 可以抑制免疫細胞及炎癥因子，對具有相同T 細胞受體的特異性CD8+和CD4+產生抑制作用，發揮免疫抑制功能［21］；DNT 還可通過抗原提呈細胞（antigen presenting cells,APC）途徑轉變成既表達特異性抗原又表達凋亡相關因子配體 (factor association suicide ligand,FASL )的“殺傷”細胞，并通過其FasL 將凋亡信號傳遞給CD8+細胞［22］。而 CD4+、CD8+及 DNT 可從 APC 上獲得主要組織相容性復合體（major histocompatibility com?plex，MHC）短肽復合物并將此抗原遞呈于其鄰近的T 淋巴細胞，從而誘導免疫耐受［23］。在兒童不同病毒感染性疾病中DNT 表達有所不同，EB 病毒引起傳染性單核細胞增多癥患者中，DNT 處于高表達［24］。而在兒童手足口病的研究中DNT 處于低表達狀態［25］。本研究結果發現無論輕癥腺病毒肺炎還是重癥腺病毒肺炎患兒中都存在一定水平的DNT 細胞，但水平顯著低于正常對照兒童，且重癥腺病毒肺炎患兒DNT 水平明顯低于輕癥腺病毒肺炎患兒，提示DNT 可能參與重癥腺病毒肺炎發生發展的過程，考慮機制可能為DNT 減少導致其免疫抑制功能降低，從而引起腺病毒肺炎氣道炎癥調節紊亂的持續存在，但具體機制仍需進一步研究。

有研究表明兒童CD3+、CD8+和CD56+百分比隨年齡增長均呈逐漸升高趨勢，CD4+、CD19+百分比及CD4+/CD8+比值隨年齡增長均呈逐漸降低趨勢，男女淋巴細胞升高、降低的程度略有不同［26］。另有研究表明，學齡前兒童隨年齡增長CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD19+呈下降趨勢，而 CD56+、CD8+呈上升趨勢［27］。還有研究表明CD3+在嬰兒期后保持相對穩定［28］。本研究對入組患兒進行年齡分層研究發現輕癥腺病毒肺炎患兒 CD3+、CD4+、CD8+、DNT 隨年齡增長呈上升趨勢，CD4+/CD8+、CD56+隨年齡增長呈下降趨勢，而重癥腺病毒肺炎患兒僅DNT 隨年齡增長呈上升趨勢，其余指標均與年齡無顯著性差異，且只有 1~3 歲年齡組患兒 CD3+、CD4+、DNT、CD19+輕、重癥腺病毒肺炎比較差異有統計學意義，提示腺病毒感染1~3歲兒童可引起更加嚴重的免疫功能的紊亂，考慮與1 歲以內的患兒帶有一定的母體免疫，3 歲以上兒童免疫功能逐漸完善，1~3 歲患兒免疫功能發育不完善有關。

綜上所述，腺病毒感染人體后引起臨床癥狀輕重與機體免疫功能紊亂有關，病情越重細胞免疫抑制程度越明顯，尤其是對于1~3 歲兒童，CD4+、CD8+T 細胞是介導腺病毒感染的免疫應答主要細胞，DNT 減少導致其免疫抑制功能降低，從而進一步加重免疫功能紊亂狀態，促進病情的進一步加重，所以對腺病毒肺炎患兒進行外周血淋巴細胞亞群測定可為預測病情的發展提供一定依據。