SPF大白豬和長白豬CIITA基因剪接突變體的鑒定分析及在不同組織中的表達模式

馬麗娜，劉英華，王有祺，高彩霞*，陳洪巖1,*

(1.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150000； 2. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室 實驗動物與比較醫學創新團隊 國家禽類實驗動物資源庫，哈爾濱 150069)

豬主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)也叫豬白細胞抗原(swine lymphocyte antigen, SLA)，它包含3 個主要的基因簇(I類、II類和III類)，其中II類基因簇包含較多基因，但只有SLA-DQ和SLA-DR基因具有功能作用且具有高度的多態性[1-3]。SLA II類抗原主要表達在專職性抗原提呈細胞表面，主要負責提呈外源性抗原給CD4+輔助性T細胞從而引起機體產生免疫應答[4-5]。SLA II類分子功能的實現需要其編碼基因按照嚴格的細胞特異性和定量調控模式進行轉錄調控，這個復雜的基因表達譜幾乎完全由一個主調控因子控制，稱為SLA II類分子的反式激活因子CIITA(major histocompatibility class II transactivator)[6-8]。它通過蛋白的羧基端結合到SLA II類分子啟動子上的多個轉錄因子上相互作用，成為這些轉錄因子的支架，共同發揮對SLA II類分子表達的調控作用[9-11]。CIITA于1993年首次被發現，一名患者主要因為CIITA基因的功能缺陷等原因導致不能正常編碼MHC II類分子，致使該患者無法正常進行免疫調控[12-13]。CIITA屬于NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)蛋白家族的一員，其蛋白表達具有組織特異性，僅在胸腺上皮細胞、活化的細胞和專職的抗原提呈細胞中表達，也可進行誘導性表達，在其他一些細胞中，可用IFN-γ來刺激CIITA的表達。據報道，人CIITA的組成可分為N端富含酸性氨基酸區、脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(P/S/T)的富集區、GTP結合域(GTP-binding domain, GBD)和末端富含亮氨酸的重復結構域(leucine rich repeat, LRR)[14]，每一個區域都有特定的功能，前兩者主要起到轉錄激活功能[15]。豬CIITA組成與人類似，但失去了整個GTP綁定區。此外，豬CIITA在其自然轉錄過程中可發生可變剪接，這是調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制，即通過不同的剪接方式使得一個mRNA前體產生不同mRNA突變體，造成CIITA基因核苷酸插入/缺失，從而使編碼的氨基酸序列提前終止或突變，由于這種CIITA基因剪接突變體的存在，使其蛋白功能受到影響，不能正確啟動SLA II類分子的表達，致使宿主不能發揮正常的抗原提呈功能，從而可能會進一步影響實驗豬對疾病表現出的抗性或易感性。實驗豬是畜禽疫病防控研究中重要的模式動物，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存有遺傳背景清晰且已排除了14種病原微生物的SPF(specific pathogen free, SPF)大白豬和長白豬群體[16-18]，且在重大疫病防控研究中起到了至關重要的作用。目前，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所在我國非洲豬瘟疫苗研究中取得了關鍵性的進展，其中標準化的實驗豬也是推進研究工作的重要原因之一。

目前，國內外關于CIITA基因的研究主要集中在人和斑馬魚上，對豬CIITA基因的研究較少，根據Ensemble數據庫及相關文獻的搜索發現，豬CIITA基因可能存在多種剪接突變體，因此，本研究對SPF大白豬和長白豬CIITA基因進行可變剪接分析，研究CIITA剪接突變體在不同豬組織中的表達情況，為深入探討豬CIITA基因的生物學功能及培育標準化的實驗豬提供遺傳學參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機采集中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存5周齡的8頭SPF大白豬和7頭SPF長白豬的肺組織(許可證號：SCXK(黑)2015-004)，樣本迅速放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要試劑 KOD-Plus-Neo購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；pEASY-Blunt載體購于北京全式金生物技術有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、膠回收試劑盒購于大連TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購于博日科技有限公司。

1.2.2 主要儀器 DYY-6C型穩壓電泳儀(六一儀器廠,北京)；全自動凝膠成像分析系統(Alpha Innotech,美國)；梯度PCR儀(Bio-Rad,美國)；實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM5)。

1.3 試驗方法

1.3.1 肺組織總RNA的提取和cDNA的合成 取0.1 g肺組織加入少量液氮進行研磨，研磨充分后，用博日RNA提取試劑盒提取總RNA，經紫外分光光度計測量其濃度及純度，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0范圍內的總RNA用于后續研究。隨后，使用特異性引物CIITA-R，用PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，寶生物(大連)有限公司)反轉錄為cDNA。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.2CIITA的擴增和測序 以已知豬CIITA序列(GenBank登錄號：AY084053)為參考序列，用NCBI Primer-BLAST和Primer primer5.0軟件設計1對特異性引物CIITA-F/R(表1)，對cDNA進行擴增，擴增片段包含CDS區，預期擴增大小約1 698 bp。 引物由庫美生物科技公司合成。PCR反應體系為50 μL：KOD-Plus-Neo(1.0 U·μL-1) 1 μL， 10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2 mmol·L-1) 5 μL，MgSO4(25 mmol·L-1) 3 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水32 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35個循環；68 ℃延伸10 min。 PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，用紫外分光光度計測定回收DNA的濃度，將其送庫美生物科技公司進行測序。測序獲得雜合子后，將回收片段與pEASY-Blunt Cloning kit載體連接，轉化大腸桿菌DH5α培養，菌液PCR鑒定后，篩選陽性克隆送庫美生物技術公司進行測序。

1.3.3CIITA基因序列的生物信息學分析 利用Chromas 2對測序獲得的原始序列進行核對編輯，編輯后序列通過MEGA 7.0建立數據庫；MegAlign進行核苷酸與氨基酸比對；采用MEGA 7.0對比人、鼠、牛、斑馬魚、斑點叉尾鮰、恒河猴、綿羊、雞CIITA基因編碼的氨基酸序列(表2)，分析序列同源性，構建系統發育樹；同時用Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)比較8個 豬品種預測的CIITA不同剪切體的核苷酸序列相似性，構建其氨基酸序列進化樹，各個品種不同轉錄本的ID及GenBank登錄號見表3；運用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白質二級結構進行預測；運用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對蛋白質三級結構進行預測。

1.3.4CIITA基因在SPF長白豬不同組織中的表達特性 根據獲得的CIITA序列，選取2頭攜帶CIITA-A/CIITA-C和CIITA-B/CIITA-C的SPF長白豬，頸動脈放血致死后，迅速取心、肝、脾、肺、腎、甲狀腺、胸腺和脊髓樣本，用于總RNA的提取，反轉錄為cDNA后，利用qRT-PCR方法檢測各組織中CIITA剪接突變體的表達情況，引物信息見表1。反應總體積為20 μL：上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.25 μL，cDNA 1 μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX 0.4 μL， RNAase Free ddH2O補至20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 30 s制作熔解曲線。每個樣本重復3次。

表1 引物信息

表2 不同物種CIITA序列信息

表3 不同品種豬CIITA不同轉錄本的ID及GenBank登錄號

(轉下頁 Carried forward)

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1.3.5 數據處理 應用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR檢測結果，結果以“平均值±標準誤”表示。采用SPSS version 19.0軟件單因素方差分析比較CIITA基因在不同個體和不同組織中的表達差異，用Duncan’s法進行多重比較；采用獨立樣本T檢驗進行分析；P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 豬CIITA基因可變剪接體的鑒定及特征分析

提取SPF大白豬和長白豬肺組織總RNA，反轉錄為cDNA，PCR擴增后分別獲得1 700 bp左右的條帶(圖1A)，表明成功獲得CIITA基因。分析15頭SPF大白豬和長白豬CIITA基因測序結果(圖1B)，部分豬出現雜合子，克隆測序后，共獲得了豬CIITA基因CDS區的3種可變剪接體，分別命名為CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C，獲得GenBank登錄號為MN_814329、MN_814330和MN_814331，SPF豬CIITA的基因型見表4。比較3個剪接突變體的核苷酸(圖2A)和氨基酸序列(圖2B)，結果CIITA-C與參考序列相似性最高，核苷酸同源性為99.6%，氨基酸同源性為99.5%。相對于CIITA-C，CIITA-A和CIITA-B在Exon 11同一位置分別缺失了40 和199 bp，致使終止密碼子提前，從而導致編碼的氨基酸分別缺失253和238個氨基酸殘基。

2.2 CIITA基因序列的物種間保守性

將獲得的豬CIITA-C CDS序列與人、小白鼠、牛、斑馬魚、斑點叉尾鮰、恒河猴、綿羊和雞的CIITA核苷酸和氨基酸序列進行同源性比較，發現SPF大白豬和長白豬與綿羊具有較高的同源性，達到81.1%以上。與斑點叉尾鮰的同源性較小，僅為24.9%。利用MEGA7.0軟件使用Neighbor-Joining法對CIITA基因的編碼氨基酸序列進行聚類分析，發現對于CIITA，豬與綿羊和牛具有較近的親緣關系(圖3)。

M. DNA相對分子質量標準；1、2. CIITA基因擴增結果；A圖中，框內為豬CIITA基因擴增結果M. DNA marker; 1, 2. CIITA gene amplification results; the bands in box represents the amplification products of CIITA gene in figure A圖1 豬CIITA基因的PCR擴增結果(A)和測序結果(B)Fig.1 PCR amplification results (A) and sequencing results (B) of porcine CIITA gene

表4 SPF大白豬和長白豬CIITA基因剪接突變體存在形式

2.3 不同豬品種CIITA不同剪接突變體的遺傳進化樹分析

用MEGA7.0軟件對8個不同品種豬的CIITA不同轉錄本的CDS區進行序列比對與遺傳進化分析，發現不同豬品種CIITA轉錄本具有一定的保守性，其同源性為65%～100%。SPF大白豬和長白豬中獲得的CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C與landrace-206、jinhua-206、pietrain-207、mei-shan-206、rongchang-206、bamei-206、pietrain-206和usmarc-201聚為一支，表明SPF大白豬和長白豬與usmarc、皮特蘭、巴美豬、榮昌豬、梅山豬和金華豬親緣關系較近(圖4)。

2.4 CIITA基因蛋白質二級結構與三級結構預測

運用SOPMA在線預測豬CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C編碼蛋白的二級結構元件，發現3個剪接突變體中α螺旋(alpha helix)、β折疊(beta turn)、無規則卷曲(random coil)和延長片段(extended strand)4種 二級結構所占比例比較接近(表5)。但是利用DNA star軟件子程序Protean對CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C進行了結構域的預測，發現由于CIITA-A和CIITA-B中終止密碼子的提前致使編碼蛋白的結構域受到了剪接的影響，均缺失了末端富含亮氨酸的4個重復結構域(LRRs)(圖5)。利用SWISS-MODEL在線預測發現，由于Exon 11部分核苷酸的缺失以及終止密碼子的提前，使得蛋白質的三級結構發了明顯的改變(圖6)。

2.5 CIITA基因剪接突變體在豬不同組織中的表達分析

利用qRT-PCR方法檢測豬各組織中CIITA剪接突變體的表達情況，結果發現，CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C在各個主要組織中均有表達。在CIITA-A/CIITA-C豬的不同組織樣本中(圖7A)，CIITA-A與CIITA-C表達量趨勢一致，均在脾中表達量最高，其次是脊髓、腎、肺、甲狀腺、肝、胸腺，在心中表達最低。除了肺外，CIITA-C的表達量均高于CIITA-A，在肝中差異極顯著(P<0.001)。在CIITA-B/C豬不同組織樣本中(圖7B)，CIITA-B在肺中表達量最高，CIITA-C在脾中表達量最高，同樣在心中表達量最低；除了脊髓外，在其他組織中CIITA-B表達量高于CIITA-C，在脾、甲狀腺和胸腺中差異顯著(P<0.05)。

A. 豬CIITA核苷酸序列比對結果，陰影區域內為缺失片段；B. 豬CIITA氨基酸比對結果A. The nucleotide sequence alignment result of porcine CIITA, and the shadow regions are the deletion fragments; B. The amino acid alignment result of porcine CIITA圖2 豬CIITA核苷酸與氨基酸序列比對結果Fig.2 Aligning results of porcine CIITA nucleotide and amino acid sequences

圖3 不同物種CIITA基因遺傳進化樹Fig.3 The genetic evolution tree of CIITA gene in different species

圖4 不同豬品種CIITA不同剪接突變體的遺傳進化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of different splicing mutants of CIITA in different pig breeds

表5 豬CIITA不同可變剪切體氨基酸序列預測信息

方框區域為CIITA-A與CIITA-B共同缺失部分The box area is the common missing part of CIITA-A and CIITA-B圖5 CIITA與兩種突變體結構與預測Fig.5 The structure and prediction of CIITA and two mutants

圖6 豬CIITA蛋白三級結構預測Fig.6 The prediction of tertiary structure of CIITA protein

*、**、***分別表示在同一組織中CIITA-A、CIITA-B、CIITA-C的表達量差異達顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01，P<0.001)*, **, *** indicate the expression of CIITA-A, CIITA-B, CIITA-C in the same tissue was significantly different (P<0.05), extremely significantly different (P<0.01, P<0.001), respectively圖7 CIITA基因剪接突變體在豬不同組織中的表達Fig.7 Expression of splicing mutants of CIITA gene in different tissues of pigs

3 討 論

MHC II類分子提呈經過加工的外來抗原給CD4+T細胞的抗原受體，導致CD4+T細胞激活和分化，從而在誘發免疫應答中起重要的作用[19-22]。CIITA是MHC II類分子重要的轉錄激活因子，其研究價值也變得十分重要[23-24]。CIITA作為非DNA結合轉錄激活因子，是調控MHC II類分子表達最主要的轉錄分子之一，決定了MHC II類分子表達的高低[25-26]。CIITA基因前體mRNA存在選擇性剪切，不同的選擇性剪切體形式編碼不同分子量的蛋白，致使CIITA蛋白具有多樣性，從而功能也產生差異，有些剪切體將不能正確啟動MHC II類分子的表達，使宿主不能發揮正常的抗原提呈功能。CIITA的剪接突變可引起機體產生一系列的癥狀，例如，裸淋巴細胞綜合征(bare lymphocyte syndrome, BLS)主要是由于CIITA基因發生了剪接突變，終止密碼子提前，導致后續所編碼的蛋白質縮短，不能正常發揮功能，使患者發生感染，并引發一系列的并發癥[27]。也有研究表明，人CIITA LRR丙氨酸突變既消除了CIITA的反式激活能力，又消除了具有N端缺失的CIITA突變體的顯性陰性表型[28]。此外，目前異種器官移植研究已成為醫學熱點之一。由于人與豬的基因同源性和遺傳特征較為相似，使其成為理想的動物模型，所以現在研究多集中于人與豬之間異種器官移植[29]，突變后的人CIITA(缺少N端的基因序列)可以跨越種間屏障，用該突變體搶先結合豬SLA II類分子從而可抑制其轉錄[30]。對于病原體會通過使用各種策略來避免宿主發出的保護性免疫反應。為了抑制MHC II類分子的表達和建立CD4+T細胞的依賴性免疫應答，許多病原體已經開發出干擾CIITA功能或表達的方法。例如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，HIV Tat蛋白通過與CIITA競爭結合從而干擾CIITA的正常功能[31]。以上的研究表明，CIITA的剪接突變在自身免疫病與移植反應中起到了十分重要的作用。

CIITA不同剪接突變體與豬品種和群體中個體差異有關，已經預測不同品種豬中均存在CIITA不同剪接突變體，蘇麗娟[32]從長白豬中擴增獲得了2個CIITA突變體。本研究所用的SPF大白豬和長白豬是中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存的一批優良試驗動物，遺傳背景清晰，已排除14種病原微生物，與普通級豬相比，SPF豬更容易排除無關變量及試驗之外最大化的未知干擾，也可排除病原微生物引起CIITA的誘導性表達。利用RT-PCR擴增和測序共獲得了3種CIITA剪接突變體形式，其中CIITA-A和CIITA-B突變體分別缺失了40 和199 bp，使終止密碼子提前，從而導致編碼的氨基酸縮短。缺失40 bp的突變體序列與蘇麗娟[32]獲得的CIITA8一致。對CIITA蛋白二級結構分析發現，3個剪接突變體中α螺旋、β折疊、無規則卷曲和延長片段所占比例非常接近，進一步分析三級結構發現，缺失核苷酸突變體的蛋白結構也受到了剪接的影響，均缺失了末端富含亮氨酸的4個LRRs，使蛋白質的三級結構發生了明顯的改變。現已證明，SLA基因是一個重要的抗病育種分子標記[33]。不同SLA單倍型豬對疫病抗病性不同，因此CIITA作為調控SLA II類分子表達的反式激活因子，其剪接突變體的鑒定對抗病育種具有一定的指導意義，剪接突變體編碼蛋白結構的缺失不能正確啟動SLA II類分子的表達，致使宿主不能發揮正常的抗原提呈功能，從而可能會進一步影響試驗豬對疾病表現出抗性或易感性，在群體中表現出個體差異，由此可篩選出免疫功能較強的個體，提高豬的抗病力，從而有望培育出抗病力較強的品種或品系[34-35]。

與其他物種的CIITA相比較，發現豬與綿羊和牛具有較近的親緣關系，而在不同豬品種中進行比較時，發現3種CIITA剪接突變體聚為一支，且SPF大白豬和長白豬與usmarc、皮特蘭、巴美豬、榮昌豬、梅山豬和金華豬具有共同的起源。針對單個基因來講，尤其是對被CIITA調控的SLA基因，權金強等[36]、江新杰等[37]利用來源相同的SPF大白豬和長白豬研究了SLA-1和SLA II類分子特征，系統發育樹構建結果表明，SPF大白豬和長白豬與Yucatan、韓國本地豬和梅山豬等親緣關系較近，與本研究具有相似性，都與梅山豬親緣關系較近。推測某些地方豬種早期培育中可能引入了大白豬或長白豬的血緣，從而表現出較近的親緣關系。

本研究發現，不同的CIITA剪接突變體在所檢測的組織中均有表達，且表達量趨勢一致，均在脾或肺中表達量較高，其次是腎、脊髓、甲狀腺、肝、胸腺，在心組織中表達最低，這種表達差異主要是由于不同組織主要構成細胞與功能不同引起的，CIITA蛋白可在胸腺上皮細胞中表達，也可在活化的細胞和專職的抗原提呈細胞中表達，因此，在免疫器官中表達相對較高，其他器官中相對較低。但在本研究中，與胸腺相比，不同剪接突變體在肺中的表達量較高。CIITA是SLA II類分子的反式激活因子，而SLA II類分子主要表達在起抗原提呈作用的專職性抗原提呈細胞，而肺泡中主要含有肺泡巨噬細胞，該細胞屬于專職性抗原提呈細胞并會影響其表達量的提高。胸腺屬于人體淋巴系統中的重要器官，是T淋巴細胞分化、發育和成熟的場所，由淋巴細胞和網狀細胞組成，這可能是CIITA突變體在肺中表達量比胸腺中高的原因之一。此外，剪接突變可能會使功能性CIITA的表達量降低，導致其不能發揮正常功能。根據同一基因的不同轉錄本表達量可以區分亞型，表達量最高的轉錄本為主要亞型，表達量相對較低的轉錄本為次要亞型[38]。在CIITA-A/CIITA-C型個體同一組織中CIITA-C的表達量均高于CIITA-A，甚至在肝中達到極顯著，所以在此樣本中CIITA-C為主要亞型。在CIITA-B/CIITA-C型個體不同組織中，CIITA-B表達量高于CIITA-C，所以CIITA-B為主要亞型。CIITA剪接突變體在個體內表達稍有差異，表現的主要亞型有所不同，可能會對后續的CIITA在自關聯、核質轉運和MHC-II基因轉活化方面都會表現出一定功能上的影響，其后續影響還有待進一步研究[39-40]。

4 結 論

本研究從SPF大白豬和長白豬中克隆測序共獲得了3個CIITA剪接突變體，其中兩個突變體由于終止密碼子的提前致使編碼CIITA蛋白的結構域受到了剪接的影響，缺失了末端富含亮氨酸的4個 重復結構域，蛋白結構發生了明顯的改變，而且針對CIITA，豬與綿羊和牛具有較近的親緣關系，且在不同豬種中具有一定的保守性。CIITA不同剪接突變體在豬不同組織中均有表達，表達量稍有差異，本研究為進一步研究豬CIITA功能及其在動物體內的相關調控機制奠定了理論基礎。