DNA甲基化調控牛AQP1基因的胎盤特異性印記

劉曉倩，靳蘭杰，董艷秋，李冬杰，張 萃，谷書凱，李世杰*

(1.河北農業大學生命科學學院, 保定 071000; 2.河北科技大學生物科學與工程學院, 石家莊 050018)

在哺乳動物細胞中，絕大多數位于常染色體上的基因在子代中表現為雙等位基因表達，且親本等位基因的表達水平相同。然而，一部分基因表現為只在母源染色體上表達或只在父源染色體上表達，此現象稱為基因組印記[1]。根據親本等位基因的表達狀態，分為母源印記基因和父源印記基因。基因印記不僅調控胚胎和胎盤的生長，而且在胎兒出生后的生長，以及在大腦功能方面均有重要作用[2-3]。印記基因的表達紊亂還與癌癥的發生和發展有關[4]。

水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)基因編碼質膜水運輸蛋白[5]，在小鼠(Musmusculus)6號染色體的Mest-Nap1l5印記區域內被鑒定為胎盤特異性的父源印記基因[6]。AQP1基因的表達與腫瘤的發生發展有關。AQP1基因表達上調會使細胞膜電位發生變化，并激活Wnt[7]、FAK[8]等一系列下游信號通路，從而促進細胞增殖及血管生成，影響腫瘤的發生發展[9]。AQP1基因的DNA甲基化調控與唾液腺腺樣囊性癌、結腸癌等惡性腫瘤密切相關[10-11]。AQP1基因的缺失可以保護腦外傷，降低腫瘤生長[12]。AQP1基因在其他物種中的印記狀態尚未被揭示，本研究首先對AQP1基因在牛(Bostaurus)中的印記狀態進行分析。

調控印記的表觀遺傳修飾方式有多種，其中DNA甲基化最為重要，其中差異甲基化區(differentially methylated region, DMR)起調控作用，位于啟動子區的DMR發生甲基化異常會直接導致印記基因出現雙等位表達或沉默[13]。本研究應用亞硫酸氫鹽測序法對牛AQP1基因啟動子和第一個外顯子區CpG島在組織和胎盤中的DNA甲基化狀態進行了分析，以揭示DNA甲基化修飾在調控AQP1基因印記表達中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

32頭成年雌性荷斯坦奶牛組織樣本取自河北省保定市當地屠宰場，屠宰后立即采集每個個體的組織樣本(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪)放入液氮中；15個自然分娩后的胎盤樣本取自保定市某奶牛養殖場，并收集每個胎盤樣本對應的母本血液和父本精子。所有樣本-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛組織及胎盤的RNA提取及反轉錄 利用RNAios plus試劑盒(TaKaRa，中國)提取各組織及胎盤的總RNA；利用UEIrisⅡ RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis (with dsDNase, US Everbright Inc, 美國)將RNA反轉錄為cDNA，置于-20 ℃凍存。

1.2.2 牛組織及胎盤的RT-PCR 通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站查找牛AQP1 的mRNA序列(NC_037331.1)，在UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)Blat查找AQP1基因的DNA序列，利用Primer 5軟件設計引物AQP1-2F和AQP1-R(表1)，通過PCR擴增各組織及胎盤的cDNA。以GAPDH(Accession No.:BTU85042)為內參基因，設計引物Gap-F和Gap-R，擴增無內含子片段長度為375 bp。PCR反應體系(25 μL)：10×LA Tap Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，LA Taq DNA聚合酶0.1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL， 模板1 μL(50 ng)，ddH2O 17.4 μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 牛心組織及胎盤的DNA提取及SNP鑒定 利用DNA提取試劑盒(生工，上海)提取32頭 荷斯坦奶牛心組織的DNA和15頭荷斯坦奶牛胎盤的DNA。引物為AQP1-1F、AQP1-R(表1)通過PCR擴增技術擴增1 615 bp的DNA片段。PCR反應體系及條件同“1.2.2”，其中退火條件為52 ℃， 60 s。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對產物進行純化回收及測序。查看測序結果，找到雙峰的SNP位點即可確定雜合子個體。

表1 引物信息

1.2.4 牛雜合子個體和雜合子胎盤的等位基因表達及印記狀態分析 以雜合子個體各組織(心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪)及胎盤cDNA為模板，利用跨內含子引物AQP1-2F、AQP1-R， PCR擴增包含SNP位點的717 bp片段。反應體系及條件同“1.2.2”，反應條件中退火的溫度為52 ℃。對擴增產物進行回收測序。通過SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因的等位基因表達狀態。結合雜合子胎盤對應的父母基因型，確定AQP1基因的印記狀態，若SNP位點表達與父本相同，則為父源表達母源印記；若SNP位點表達與母本相同，則為母源表達父源印記。

1.2.5 亞硫酸氫鹽處理DNA模板及巢式PCR擴增 使用Zymo甲基化試劑盒對牛基因組DNA模板進行亞硫酸氫鹽處理，從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取牛AQP1基因序列，分析基因啟動子區富含CG的序列，利用MethPrimer在線軟件對序列進行轉換，即非CG位點的C均替換為T，并依據此序列設計甲基化特異的巢式PCR引物(表1)。巢式PCR外側引物為M-F1、 M-R1，擴增片段長度為582 bp；內側引物為M-F2、M-R2，擴增序列長度為471 bp，引物序列見表1。外側引物PCR擴增體系及條件同“1.2.2”，反應條件中退火的溫度為50.6 ℃。取1 μL PCR產物稀釋30倍后作為內側引物擴增的模板，PCR反應體系及條件同“1.2.2”，反應條件中退火的溫度為49.9 ℃。將二次PCR產物進行膠回收，產物進行克隆測序。

1.2.6AQP1基因啟動子DNA甲基化PCR產物克隆、測序 將pMD19-T載體(TaKaRa)與膠回收產物進行連接，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，加入500 μL LB液體培養基，在37 ℃搖床內150 r·min-1搖菌培養2 h。配制含有氨芐青霉素(100 mg·mL-1)的固體LB培養基，倒于培養皿中，向培養基中加入4 μL IPTG(200 ng·μL-1)和25 μL X-gal(20 mg·μL-1),取培養好的菌液200 μL， 均勻涂到培養基上，倒置于37 ℃恒溫箱中，培養過夜。次日挑取白色單一陽性克隆置于加有氨芐青霉素的液體培養基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養12 h。

將培養好的菌液進行測序。將檢測序列與轉化后的DNA序列進行比較，分析甲基化狀態，甲基化CpG位點的C無變化，而非甲基化CpG位點的C變成T。

2 結 果

2.1 AQP1基因在不同組織中的表達檢測

用RT-PCR檢測AQP1基因在牛7個組織中的表達情況。隨機提取3頭牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織的RNA及3個胎盤的RNA，反轉錄生成cDNA，相同組織cDNA混合為模板，用AQP1-2F和AQP1-R為引物，均獲得1條長為717 bp的序列條帶(圖1A，圖2A)。對擴增產物進行回收并測序，序列分析確定為AQP1基因外顯子片段，表明AQP1基因在牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪組織和胎盤中均有較高的表達量。

2.2 AQP1基因在牛組織中的等位基因表達分析

2.2.1 牛組織中AQP1基因的SNP檢測 以32頭牛的基因組DNA為模板，擴增AQP1基因片段，引物為AQP1-1F和AQP1-R，得到1 615 bp的DNA片段，產物直接回收測序，分析測序峰圖發現兩個雜合SNPs(rs382748905、rs108948845)位點(圖1B)，分別位于擴增產物的786 bp(C/T)和1 033 bp (T/C)處。存在雜合SNP的個體稱為雜合子個體，鑒定出的雜合子個體與純合子個體比例為5∶27。鑒定的雜合子牛用于AQP1基因在牛組織的等位基因表達分析。

2.2.2AQP1基因在牛組織中的等位基因表達分析 對比雜合子牛的DNA水平和不同組織的轉錄水平SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因在牛不同組織中的表達狀態。結果顯示，AQP1基因兩個SNPs在7個被檢測的牛組織中均為雙峰(圖1C)，表明AQP1基因在被檢測的組織中為雙等位基因表達。

2.3 AQP1基因在牛胎盤中的等位基因表達分析

2.3.1 牛胎盤中AQP1基因的SNP檢測 以15頭牛胎盤的基因組DNA為模板，用2.2.1相同引物擴增AQP1基因片段，得到1 615 bp的DNA片段，產物直接回收測序，分析測序峰圖發現1個雜合SNP(rs380460668)位點(圖2B)，位于擴增產物680 bp(T/C)處。存在雜合SNP的胎盤稱為雜合子，鑒定出的雜合子與純合子比例為1∶4。鑒定的3個雜合子牛胎盤用于AQP1基因在牛胎盤中的表達分析。

2.3.2AQP1基因在牛胎盤中的等位基因表達分析 對比雜合子牛胎盤在DNA水平和轉錄水平的SNP位點處測序峰圖，確定AQP1基因在牛胎盤中的表達狀態。結果顯示，AQP1基因1個SNP在牛胎盤中SNP位點為單峰(C/T)，即AQP1基因在牛胎盤中為單等位基因表達。同時檢測雜合子胎盤對應的親本基因型，結果顯示，表達為C的雜合子胎盤對應的父本為T純合，母本為C純合；表達為T的雜合子胎盤對應的父本為C純合，母本為T純合(圖2B)。因此確定，牛AQP1基因在胎盤中為母源等位基因表達。

2.4 AQP1等位基因特異的甲基化狀態分析

通過利用亞硫酸氫鹽測序法分析AQP1基因位于啟動子和第一個外顯子區的CpG島在牛精子、胎盤、心臟和肝臟組織中的DNA甲基化狀態，來確定DNA甲基化在AQP1基因印記表達中可能的作用。將雜合子牛組織 DNA(6號牛的心臟和肝臟DNA)、雜合子胎盤DNA(1、2號胎盤DNA)及對應精子DNA進行亞硫酸氫鹽處理后作為甲基化模板，使用巢式PCR引物M-1F和M-1R (表1)擴增582 bp片段，擴增產物直接測序，發現1個雜合位點A/G(rs479118658)，該位點用于區分等位基因的兩條鏈(A鏈和G鏈)。用引物M-2F和M-2R擴增包含上述雜合位點的471 bp區域，包括15個CpG位點(圖3A)。將擴增產物進行克隆測序。克隆測序結果顯示，在雙等位基因表達的雜合子牛心臟、肝臟組織中，兩條親本鏈(A鏈和G鏈)均呈現重甲基化狀態；以2個單等位基因表達的雜合子牛胎盤為例，在單等位基因表達的雜合子牛胎盤中，兩條親本鏈(A鏈和G鏈)呈現出甲基化差異，A鏈為輕甲基化狀態，G鏈為重甲基化狀態；同時對應的父源等位基因(G鏈)精子中為重甲基化狀態(圖3B)。以上研究結果說明，DNA甲基化修飾參與調控牛AQP1基因的胎盤印記表達。

3 討 論

目前，在人(Homosapiens)和小鼠中被鑒定的印記基因有150多個[14]，而與人和小鼠相比，已在牛中被鑒定的印記基因數目較少。水通道蛋白(AQPs)是一種小的膜蛋白家族，對水和小的中性溶質在多種生物膜中的跨膜運輸起促進作用[15]。其中,Aqp1基因編碼的AQP1蛋白是該家族中第一個被發現的成員[12,16]，是目前該家族中被主要研究的成員。AQP1是人體紅細胞的主要水分通道，負責調節紅細胞的水滲透性[17]，并協助氣體通過紅細胞膜運輸[18-19]。本研究應用RT-PCR方法分析AQP1基因在牛不同組織中的表達，發現AQP1基因在牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中廣泛表達。而Aqp1基因在小鼠的肺[20]、腎[21]、回腸[22]、微血管和心的內皮細胞[23]中也均有表達。說明AQP1/Aqp1基因在不同組織的發育中有非常重要的作用。

A. AQP1在牛被檢測組織中的表達：1～7.心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪；M.DNA 相對分子質量標準(DL2000：2 000、1 000、 750、500、250、100 bp)；RT-．陰性對照。B.牛AQP1基因SNPs的鑒定，箭頭位置為SNPs位置。C.雜合子牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪的RT-PCR測序峰圖，箭頭位置為SNPs位置A.The expression levels of AQP1 in different tissues of cattle：1-7.RT-PCR products obtained from heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat；M. DNA marker(DL2000：2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-. Negative control. B. Identification of SNPs in bovine AQP1 genes, the arrows point the position of SNPs. C. Sequence chromatograms of RT-PCR products obtained from 7 tissues of heterozygous cattle, including heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat, the arrows point the position of SNPs圖1 牛AQP1基因在不同組織中的表達及印記狀態Fig.1 Expression and imprinting status of AQP1 gene in different tissues of cattle

A.AQP1在牛胎盤中的表達：1～3.胎盤1、2、3; M. DNA相對分子質量標準(DL2000：2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；RT-．陰性對照。B. 牛胎盤基因組中AQP1基因SNPs的鑒定，及通過SNP位點對3個雜合子胎盤的gDNA、cDNA及父母源基因型進行對比，結果顯示，AQP1基因為母源表達父源印記A.The expression levels of AQP1 in placenta of cattle: 1-3.RT-PCR products obtained from different placentas; M. DNA marker(DL2000：2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-. Negative control. B. Identification of AQP1 gene SNPs in cattle placenta genome, and comparison of gDNA, cDNA and parental genotypes of 3 heterozygous placentas through SNP sites, results showed that AQP1 gene was the expression of maternal paternal imprinting圖2 牛AQP1基因在胎盤中的表達及印記狀態Fig.2 Expression and imprinting status of AQP1 gene in different placentas of cattle

胎盤對哺乳動物的發育至關重要，它參與了母體和胎兒之間氣體、營養和廢物的交換[24]。許多印記基因在胎盤中表達，在胎盤中它們合成控制細胞周期、細胞信號和血管化以及營養物質攝取、利用和儲存的蛋白質[25]，調控胚胎和胎盤的生長發育[26]。例如，Grb10調控胚胎和胎盤的重量[14]，Phlda2抑制胎盤滋養層的發展，調節胎盤的營養需求[27]。胎盤印記基因的表達也可能作為未來反映健康狀況的生物標志物，如嬰兒神經發育和4歲時的骨骼健康[28-29]。母源等位基因表達的缺失會促進母體營養物質向胚胎的轉移，從而抑制胎盤的生長，而父源等位基因表達的缺失則會促進胎盤生長發育[30-32]。在小鼠中，Aqp1基因被鑒定為母源等位基因表達、胎盤特異性的印記基因[6]。在Aqp1基因敲除的小鼠中，胚胎和胎盤都過度生長，說明Aqp1基因在胎盤發育中起抑制作用[6]。本研究發現，牛的AQP1基因在心臟等組織中為雙等位基因表達，而在胎盤中呈現為母源等位基因表達，這與Aqp1在小鼠為胎盤特異性印記的結果一致，說明AQP1基因在胎盤的生長發育中發揮重要作用。

A. 牛AQP1基因的基因結構及啟動子和第一個外顯子區CpG位點位置。CpG島橫跨第1個外顯子并包含15個CpG位點；箭頭為轉錄方向，黑方框為外顯子，黑點為CpG位點。B. CpG島甲基化分析。胎盤在CpG島發現甲基化差異區，組織在CpG島未發現甲基化差異區，且精子為重甲基化；白圈為非甲基化狀態，黑圈為甲基化狀態A. Gene structure and CpG location of bovine AQP1.The CpG island spans exon 1 and contains 15 CpG sites; The arrow is the direction of transcription, the black boxes are exons, the black spots are CpG sites. B. Methylation analysis of CpG islands. The CpG islands from placenta show differentially methylated region; The tissues show no differentially methylated region, and hyper-methylation status in sperm. The white circle is the non-methylated status, the black circle is the methy-lation status圖3 AQP1基因結構及啟動子區CpG島甲基化狀態Fig.3 AQP1 gene structure and methylation status of CpG islands in its promoter in bovine

DNA甲基化是哺乳動物基因組DNA上的一種主要的表觀遺傳修飾，其主要發生在富含有CpG二核苷酸的區域，亦稱為CpG島[33]。通常發生在基因啟動子和第一個外顯子區域的甲基化，通過直接抑制轉錄因子的結合，或通過與甲基化-CpG結合蛋白(methyl-CpG binding Proteins)相結合形成異染色質，從而抑制基因的表達[34-35]。在小鼠中，Aqp1基因啟動子區的甲基化調控其在不同組織中的表達[6]。此外，位于基因啟動子區的差異甲基化區(DMR)還是調控基因組印記的一種主要方式。例如，在牛的印記基因ZNF597[36]和AXL[37]的啟動子區均發現了甲基化差異區。本研究發現，在AQP1印記表達的胎盤中AQP1基因的啟動子和第一個 外顯子區域存在DMR，而在AQP1雙等位基因表達的心臟、肝臟組織中缺少此DMR，說明DNA甲基化參與調控AQP1基因的胎盤特異性印記表達。

4 結 論

AQP1基因在牛中為胎盤特異性單等位基因表達的父源印記基因，胎盤中位于AQP1基因啟動子和第一個外顯子區CpG島的DMR調控該基因的父源印記表達。AQP1基因在牛中被檢測的7個組織中為雙等位基因表達。本研究關于牛AQP1基因印記狀態和CpG島甲基化狀態的試驗結果，可為深入探討牛AQP1基因功能和印記相關的分子機理提供參考依據。