豬流行性腹瀉病毒通過miR-133c-3p/BCL2L2軸調控細胞凋亡

鄭紅青，吳旭錦*，朱小甫，尹寶英，高軍花，李艷芝，植嬋萍

(1.咸陽職業技術學院畜牧獸醫研究所，咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，咸陽 712000；2.邢臺市農業農村局，邢臺 054001； 3.衡水職業技術學院，衡水 053000； 4.廣東茂名農林科技職業學院，茂名 525000)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)最早于1971年發現于英國[1]，2010年之前的毒株由于有疫苗毒株的保護，以零星發病為主要特征。習慣上把2010年之前的PEDV毒株分到G1a組[2]。在2010年10月，我國南方幾個省發現了新的變異毒株，這些毒株主要危害7日齡以內的仔豬，仔豬發病率和死亡率可高達90%[3]。PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是有膜的單股正義RNA病毒，核酸長約28 kb，包括5′端帽子結構和3′的poly A尾。基因組有6個開放閱讀框，分別為ORF1a/1b，分別編碼S、M、E、N和ORF3，其中ORF1a/1b又被切割成16個非結構蛋白[4]。這些非結構蛋白對于病毒基因的復制至關重要。S基因可被切割成S1和S2亞單位，與病毒的進入和膜融合有關。由于RNA病毒的易突變決定了PED疫苗研發的難度[5]，目前PEDV突變毒株已經在世界范圍內進化了4個主要的組群，給我國和世界養豬業造成了重大經濟損失[3]。

微小RNA(microRNA，miRNAs)是非編碼RNA，長18～25 bp，不編碼蛋白質。成熟的microRNAs是單鏈的，通過與靶蛋白mRNA 3′UTR區域的結合，導致靶蛋白mRNA被切割，從而調控基因的轉錄水平，甚至影響蛋白翻譯的水平，調控蛋白的表達，進而調控細胞內多種生物學過程[6]。近年來的研究表明，miRNAs也可以通過直接與病毒基因組RNA結合或者通過改變細胞的轉錄譜來影響RNA病毒的復制和致病性[7]。在關于miR-133c-3p的研究中發現，它在多種細胞中發揮著調控細胞凋亡和增殖的作用。體內試驗發現，miR-133c-3p可抑制心肌細胞的纖維化和心肌肥大[8]。另外，在癌細胞的研究中發現，miR-133c-3p可抑制細胞的增殖和遷移[9-11]。

BCL2蛋白家族整合了觸發細胞存活或凋亡的信號，BCL-w蛋白(又稱為BCL2樣蛋白2)，屬于BCL2家族的成員，由BCL2L2基因編碼[12]。研究表明，BCL-w的BH1結構域的Gly94殘基可以抑制BAK的活性，BCL-w的抗凋亡作用主要通過與BAK、BAX相互作用發揮抑制細胞凋亡的作用[13]。非刺激情況下，BCL-w蛋白通常通過其疏水結構域與線粒體、內質網和核膜的脂質雙分子層結合，在靜息細胞中，BCL-w的c端結構域在疏水囊內折疊，僅松散地附著在線粒體膜上，當接收到凋亡信號時，BCL-w的c端臂通過促凋亡BH3-only蛋白的連接釋放，從而促進BCL-w與線粒體之間的緊密相互作用發揮抗凋亡的作用[14-15]。

關于PEDV感染引起細胞凋亡的機制，有研究對PEDV感染細胞轉錄組測序發現，感染前后與凋亡相關信號通路分子表達水平差異顯著[16]，并且PEDV也可以通過p53和線粒體凋亡通路促進細胞凋亡[17-18]。PEDV感染誘導Vero細胞凋亡[19]，那么PEDV是否也誘導MARC-145細胞的凋亡，這種凋亡是否由于microRNAs的表達豐度改變影響凋亡相關蛋白的表達，而凋亡蛋白表達量的改變抑制或促進了細胞凋亡呢？對這個問題的研究將對闡明PEDV致病機制具有重要意義。

本研究首先以PEDV感染MARC-145細胞為模型，分析了在PEDV感染過程中與細胞凋亡相關的microRNAs表達豐度的變化，選取差異表達最明顯的miR-133c-3p進一步探究PEDV感染誘導細胞凋亡的可能機制，以期為明確PEDV的胞內復制機制及抵抗PEDV感染提供新的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

MARC-145細胞(非洲綠猴腎上皮細胞)(咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室)實驗室保存，Vero細胞為實驗室保存，高糖DMEM細胞培養液購自美國Hyclone公司；減血清培養基OPTI-MEM、胰蛋白酶、轉染試劑Lipofectamine 2000、microRNA模擬物(miR-133-3p mimics)、模擬物對照(mimics control)、抑制劑(inhibitor)和抑制劑對照(inhibitor control)、SC、siBCL-w-1、siBCL-w-2、siBCL-w-3、CO2培養箱、生物安全柜均購自美國Thermo公司；胎牛血清購自德國PAN-Biotech公司；熒光定量試劑盒、microRNA第一股RNA合成試劑盒、總RNA提取試劑RNAiso均購自寶生物工程(大連)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(貨號：bs-0295G-HRP)和HRP標記羊抗小鼠IgG(貨號：bs-40296G-HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司；引物由北京擎科生物公司合成，引物序列見表1；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天公司； PEDV N蛋白單克隆抗體由上海獸醫研究所童光志研究員饋贈；細胞內參β-actin和BCL-w蛋白的抗體購于細胞信號通路技術公司；pmirGLO質粒購自普洛麥格公司。anti-BCL-w (2724)購自Cell Signaling Technology (CST)。

1.2 病毒和細胞培養

本研究使用的PEDV毒株為CH/HBTS/2017(GenBank收錄號：MH581489.1)，作者于2018年分離自河北唐山某暴發豬流行性腹瀉豬場的病料中。MARC-145細胞用含有10% 胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM 培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3 豬流行性腹瀉病毒感染MARC-145細胞

用Vero細胞擴增病毒，待細胞病變80%時收毒，TCID50測病毒滴度，細胞長到80%融合度，用PBS緩沖液清洗3遍，配制含5 μg·mL-1胰酶的DMEM感染液，將病毒加到MARC-145細胞上，輕輕搖勻，孵育1.5 h后棄掉毒液，換液在CO2培養箱繼續培養。

1.4 免疫熒光試驗

MARC-145長成單層細胞后，用含2 μg·mL-1胰酶的DMEM培養液感染CH/HBTS/2017毒株，感染復數為0.1 MOI。12 h后留樣用4%多聚甲醛4 ℃ 固定30 min，再用1% Triton 100室溫通透10 min， PBS洗3次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗PEDV N蛋白抗體過夜孵育，PBS洗3次， 每次5 min。FITC標記的羊抗小鼠IgG(貨號：bs-0296G-FITC)室溫孵育1 h，Hochest 33258染核5 min， 封片觀察。

1.5 TCID50的測定

經過24 h培養生長狀態良好的MARC-145細胞，消化后將濃度稀釋到2×105個·mL-1左右，鋪到96孔板，每孔加100 μL細胞混懸液，將培養板放到細胞培養箱培養24 h長成單層細胞。用10支1.5 mL離心管，每管900 μL 含10 μg·mL-1胰酶的DMEM培養基依次將病毒倍比稀釋(從10-1稀釋到10-10)，將96孔板培養的單層細胞用PBS洗3遍后， 按照96孔板上的列數從第1～10列將病毒稀釋液依次加入，剩余只加培養基作對照。第3天用Reed-Muench方法計算TCID50。

1.6 細胞轉染

將MARC-145細胞以2×105個·孔-1的密度接種至12 孔板，待細胞長到80%融合度時進行轉染。按照LipofectamineTM2000 轉染試劑使用說明書，將mimics control(MC)、miR-133c-3p、inhibitor、inhibitor control(IC)和LipofectamineTM2000分別跟OPTI-MEM混合，室溫靜置5 min后，將合成的模擬物和抑制劑的混合液及其對照分別跟Lipofectamine混合液混合，輕輕混勻，靜置15 min后，輕輕滴到細胞培養液上。

1.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)

培養細胞處理后用PBS沖洗3遍，加RNAiso到細胞表面，靜置5 min，按照廠家說明書提取細胞的總RNA。用500 ng的細胞總RNA用逆轉錄試劑盒得到cDNA，按照microRNA逆轉錄試劑盒說明書所示，合成microRNA的cDNA，使用定量PCR試劑盒和特異性引物(表1)進行熒光定量PCR的反應體系配制，使用熒光定量PCR儀在反應條件：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 20 s、62 ℃ 30 s，40個循環，72 ℃ 3 min條件下進行反應。

其中microRNA內參使用試劑盒中的U6 small RNA引物，BCL2L2內參為GAPDH，采用2-ΔΔCt法計算miRNA和BCL2L2 mRNA表達。

1.8 MTT試驗

每孔約5×103個細胞接種于96孔板，到80%融合度時將模擬物對照按照0、20、50 nmol·L-1轉染MARC-145細胞，6 h后更換新鮮培養基，24 h后移除培養基，每孔加20 μL 5 mg·mL-1無菌的MTT染料，37 ℃培養4 h，每孔加150 μL的DMSO，讀取490 nm的吸光值。

1.9 流式細胞術

經過不同處理的細胞用胰酶消化下來，用PBS洗1遍，用FACS buffer重懸，單細胞懸液在Annexin V中室溫孵育30 min上機檢測。

1.10 熒光素酶報告基因試驗

將含有miR-133c-3p結合位點的BCL2L2 3′UTR區域的野生型(WT)和突變型(MuT)連接到pmirGLO熒光素酶報告基因質粒，分別命名為pmir-BCL2L2-WT和pmir-BCL2L2-MuT，將miR-133c-3p模擬物和模擬物對照(MC)跟上述2個質粒分別轉染進MARC-145細胞，48 h后，按照熒光素酶報告基因試劑盒使用說明使用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

表1 引物序列

1.11 Western blot

將含蛋白酶抑制劑的RIPA加到處理細胞表面，冰上孵育30 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清提取細胞的總蛋白。提取的總蛋白用蛋白定量試劑盒定量，SDS-PAGE電泳時每孔加相同的蛋白量，電泳完畢轉到PVDF膜，轉膜完成后用5%的脫脂奶粉液封閉，然后用一抗[PEDV N蛋白抗體或anti-BCL-w (2724)]4 ℃孵育過夜，再用HRP標記二抗(羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG)室溫孵育2 h，TBST洗3遍，使用曝光顯影液進行曝光。

1.12 統計分析

2 結 果

2.1 PEDV感染MARC-145細胞并誘導細胞凋亡

將PEDV毒株CH/HBTS/2018株以0.1和1 MOI感染MARC-145細胞，細胞在0、12和24 h后細胞病變如圖1a所示，在感染12 h后細胞也出現了融合的現象，但融合細胞數量比較少，在感染24 h后1 MOI感染的細胞病變出現了片狀融合。12和24 h病毒的滴度如圖1b所示，1 MOI感染后24 h病毒滴度在6.5 lgTCID50·mL-1左右，0.1 MOI感染24 h后病毒滴度在4.2 lg TCID50·mL-1左右。由結果可知，病毒可以在MACR-145細胞高效增殖。在病毒感染12 h后留樣，間接免疫熒光示蹤病毒，檢測病毒感染細胞的情況，如圖1c所示，病毒以0.5和0.1 MOI感染可以在MARC-145細胞內高效復制。分別以0.0、0.1、0.5、1.0 MOI感染MARC-145細胞，流式細胞術檢測PEDV感染MarC145細胞24 h后細胞的凋亡情況，如圖1e所示，與對照組相比，感染0.1 MOI病毒12 h后，細胞凋亡率顯著升高(圖1d)(P<0.05)，隨著感染復數的增大，細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。

2.2 PEDV感染引起miR-133c-3p顯著上調

為了進一步探究PEDV感染引起細胞凋亡的原因，進一步從RNA水平揭示PEDV誘導細胞凋亡的機制，選擇了6個文獻中報道的影響細胞凋亡的microRNAs，分別是miR-133c-3p、miR-7、miR-186-5p、miR-155、miR-149-5p、miR-138-5p。使用RT-qPCR方法檢測在PEDV感染前后它們的表達差異。如圖2所示，miR-133c-3p的表達顯著上調(P<0.01)，miR-149-5p略有升高(P<0.05)，miR-138-5p表達下調(P<0.05)，miR-7、miR-186-5p和miR-155的表達在PEDV感染前后差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 過表達miR-133c-3p促進了細胞凋亡

將合成的miR-133c-3p的模擬物對照(MC)轉染細胞后，用MTT試驗檢測細胞活性，結果表明0、20、30、50 nmol·L-1的轉染濃度不影響細胞活性(圖3a)。轉染miR-133c-3p后6 h感染PEDV，繼續感染18 h后收樣，流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，miR-133c-3p過表達并感染PEDV后細胞凋亡率顯著升高(P<0.001)(圖3)。

2.4 敲低miR-133c-3p抑制了病毒感染引起的細胞凋亡

將miR-133c-3p的抑制劑轉染MARC-145 12 h換液后感染1 MOI病毒，繼續培養12 h后收取細胞樣品，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，敲低miR-133c-3p后細胞凋亡率明顯下降(P<0.01)(圖4)。

2.5 PEDV感染后下調了miR-133c-3p的靶基因BCL-w的表達

為了進一步確認miR-133c-3p調控的靶基因，使用生物信息學在線預測網站(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測其靶基因，熒光素酶報告基因用來驗證miR-133c-3p和BCL2L2 3′UTR區域的結合。結果發現，BCL2L2基因的3′UTR區域有miR-133c-3p的結合位點(圖5a)，進一步檢測了miR-133c-3p的模擬物(mimic)和模擬物對照(MC)轉染組的熒光素酶活性，結果發現，miR-133c-3p可以顯著降低野生型報告基因質粒的熒光素酶活性，而對突變型質粒沒有影響(P<0.01)，這表明miR-133c-3p可以與BCL2L2靶基因區域的結合(圖5b)。Western blot檢測了細胞內轉染miR-133c-3p 24 h時BCL-w蛋白的表達，結果發現，miR-133c-3p可以在細胞內下調BCL-w基因的表達水平，并且PEDV感染也可以下調BCL-w的表達水平(P<0.001)(圖5c)。

2.6 敲低BCL-w可以促進細胞凋亡

為了檢測BCL-w是否影響細胞凋亡，合成3條siRNAs，分別將siRNA control(SC)、siBCL-w-1、siBC-Lw-2、siBCL-w-3(序列見表1)轉染MARC-145，Western blot檢測細胞內BCL-w的表達水平，由圖6a可知，siBCL2L2-3敲除效率最高。將SC和siBCL-w-3轉染細胞后流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，敲低BCL-w的表達水平促進了細胞凋亡(圖6b)。

a.不同感染復數PEDV感染MARC-145細胞的病變；b.不同感染復數感染MARC-145細胞后12和24 h后病毒的滴度；c.IFA檢測PEDV感染MARC-145細胞的感染情況；d.不同劑量 PEDV 導致細胞凋亡百分比柱狀圖；e.流式細胞儀檢測 PEDV 誘導 MARC-145細胞凋亡程度；與Mock組比較，*. P<0.05和**. P<0.01表示顯著差異。下同a. Cytopathy infected with 0.1 and 1 MOI virus in MARC-145 cells. b. Virus titer infected with 0.1 and 1 MOI virus in MARC-145 cells; c. Results of of MARC-145 cells apoptosis that are detected by flow cytometry after 0, 0.1, 0.5, 1 MOI of the PEDV infected; d. Histogram of apoptotic rate in different dose of PEDV; e. The apoptosis of Marc-145 cells induced by PEDV detected by flow cytometry. Compared with Mock group, *.P<0.05, **.P<0.01 and * * *.P<0.001 indicate significant difference at 0.05, 0.01 and 0.001 level, separately, the same as below圖1 流式細胞術檢測豬流行性腹瀉病毒感染MARC-145細胞的凋亡率Fig.1 The apoptotic rate of MARC-145 cells was measured after PEDV infection by using flow cytometry

3 討 論

PEDV感染仔豬后能引起仔豬尤其是7日齡以內的仔豬嚴重的腹瀉，給我國和世界養豬業造成了嚴重的經濟損失[20-21]。由于RNA病毒易突變的特性，至今沒有有效的疫苗可用，因此急需對病毒感染細胞的機制進行深入研究。

圖2 與凋亡相關的microRNAs表達情況Fig.2 Expression of microRNAs related to apoptosis

本試驗通過檢測PEDV感染細胞時凋亡相關microRNAs的表達差異，發現了與PEDV感染關系密切的miR-133c-3p，為了進一步研究miR-133c-3p在PEDV感染過程中所起的作用，過表達miR-133c-3p后發現miR-133c-3p抑制了PEDV的復制，并且促進了感染細胞的凋亡。為了確定miR-133c-3p調控的主要靶點，用生物信息學的方法預測，發現在BCL2L2的3′UTR區域有其結合位點，熒光素酶報告基因試驗證明miR-133c-3p可以在體外與BCL2L2 3′UTR區域結合，在過表達miR-133c-3p后發現細胞內BCL-w的表達水平下調。

a.轉染不同濃度的模擬物對照，MTT檢測細胞活性的影響；b.凋亡率的柱狀圖；c.流式細胞術檢測過表達miR-133c-3p后細胞的凋亡率a. MTT to detect the effect of cell viability after transfection of different concentrations of mimic control; b. Histogram of apoptotic rate; c. The cell apoptosis rate after over-express of miR-133c-3p and then analyzed by flow cytometry圖3 過表達miR-133c-3p對細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of over-expression of miR-133c-3p on cells apoptosis

與IC組比較，**.P<0.01表示顯著差異Compared to IC group, **.P<0.01 indicate a significant difference圖4 敲低miR-133c-3p后細胞的凋亡率Fig.4 The apoptosis rate of cells after knock-down of miR-133c-3p

a.生物信息學方法預測在BCL2L2 3′UTR的靶向結合位點；b.miR-133c-3p可以下調野生型質粒的熒光素酶活性；c.過表達miR-133c-3p下調細胞內BCL-w和PEDV蛋白的表達的水平；與MC組比較，**.P<0.01和***.P<0.001表示顯著差異a. Bioinformatics methods to predict the target binding site in BCL2L2 3′UTR; b. miR-133c-3p down-regulate the luciferase activity of wild-type plasmids; c. Overexpression of miR-133c-3p down-regulates the level of BCL-w and PEDV in cells; **.P<0.01 and ***.P<0.001 indicate significant difference圖5 BCL2L2是miR-133c-3p的靶基因Fig.5 BCL2L2 is the target gene of miR-133c-3p

a. Western blot 檢測siRNAs的敲除效率；b.流式細胞術檢測檢測敲低BCL-w后細胞的凋亡情況，***.P<0.001表示顯著差異a. The level of BCL-w after know-down of siRNAs; b. The cell apoptosis rate after transfection of siBCL-w and then analyzed by flow cytometry; **. P<0.01 and ***.P<0.001 indicate a significant difference圖6 敲低BCL-w誘導細胞凋亡Fig.6 Know-down of BCL-w promote the cell apoptosis

凋亡是細胞為了適應外界刺激發生的程序性的死亡，病毒感染誘導細胞凋亡，而細胞凋亡會抑制病毒持續感染和擴散，從而防止組織進一步損傷[22]。研究表明，許多冠狀病毒可以誘導細胞凋亡，如中東呼吸道綜合征冠狀病毒(MERS)和SARS冠狀病毒感染都可以誘導感染細胞的凋亡[23-24]，傳染性胃腸炎病毒可以誘導PK-15細胞的凋亡[25]，而PEDV可以誘導Vero細胞凋亡[18]，本研究結果顯示，PEDV感染可誘導MARC-145細胞的凋亡，并且隨著感染復數的增大凋亡率也相應增加。病毒可以通過誘導凋亡促進病毒釋放，也可以在病毒感染的前期抑制細胞凋亡促進病毒的復制[26-27]，這可能也意味著凋亡在病毒感染的不同階段發揮不同的作用。

microRNAs是一類很短的RNA分子，在細胞增殖、分化、死亡和發育這些生物過程中發揮重要的作用，它發揮作用的機制是通過調控基因轉錄后水平而影響相應蛋白表達水平[22]。病毒在感染細胞的過程中會改變細胞內microRNAs的表達譜，而這些microRNAs會靶向重要的細胞元件，導致細胞生理過程的改變。A型流感病毒感染A549細胞后，miR-34a 的表達顯著下降[28]，而另一篇報道稱A型流感病毒引起miR-29c的表達上調[29]，我們先前在MARC-145細胞的研究中發現PEDV的感染能引起miR-671-5p表達的上調[30]，本研究發現PEDV的感染能引起細胞miR-133c-3p表達的上調，該結果說明病毒感染可能通過改變microRNAs表達的豐度來改變細胞的生理狀態。從microRNAs水平解釋PEDV感染細胞時對凋亡的調控，這將為闡明病毒和細胞互作的分子機制提供依據，從而為抗PEDV新方法的開發提供理論基礎。

病毒感染引起的microRNA變化有可能影響病毒的復制，很可能病毒存在多種促進和抑制自身復制的機制，這些機制受多種因素的影響處于動態變化中。一方面，microRNAs通過下調凋亡抑制蛋白的表達水平誘導細胞凋亡，如miR-15/16通過下調BCL2促進細胞凋亡[31]，miR-186-5p通過下調IGF-1(胰島素樣生長因子)促進細胞凋亡[32]，miR-146a通過下調BCL2誘導細胞凋亡[33]，另一方面，miRNAs通過下調凋亡激活通路的蛋白抑制細胞凋亡，如miR-C12通過抑制細胞凋亡促進皰疹病毒的復制[34]，并且，先前研究表明，miR-133c-3p可以通過靶向幾個凋亡抑制蛋白誘導細胞凋亡，如在狼瘡腎炎中miR-133c-3p通過靶向LASP1抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[35]；在膠質母細胞瘤細胞的研究中發現，miR-133c-3p可以通過抑制EGF的表達水平促進細胞凋亡，從而抑制了細胞增殖[11]。而在本研究中，PEDV感染上調了miR-133c-3p的水平，而上調的miR-133c-3p又促進了細胞凋亡，而且敲低BCL-w后誘導細胞凋亡，但是凋亡率沒有過表達miR-133c-3p所引起的凋亡率高，這可能提示，miR-133c-3p可能靶向多個凋亡抑制蛋白或通過多種途徑影響細胞凋亡。本研究不僅證明了miR-133c-3p誘導凋亡的作用，而且進一步豐富了miR-133c-3p的調控凋亡的機制。

BCL2L2作為BCL2家族蛋白的分子，是重要的凋亡抑制劑，miR-335c-5p通過下調BCL2L2的水平促進了卵巢癌細胞的凋亡，從而促進了化療的敏感性[36]，miR-126a-5p通過下調BCL2L2促進宮頸癌細胞的凋亡[37]，BCL2L2是microRNA影響細胞凋亡的過程中一個很重要的靶基因，本研究中，miR-133c-3p靶向調控BCL2L2。該結果提示，miR-133c-3p通過靶向BCL2L2調控細胞凋亡機制有可能是PEDV感染MARC-145細胞引起凋亡很重要的因素。

綜上所述，PEDV的感染誘導MARC-145細胞的凋亡，進一步研究發現，PEDV的感染顯著上調了miR-133c-3p的表達，而miR-133c-3p通過下調其靶基因下調了凋亡抑制蛋白BCL-w的表達進而誘導了細胞凋亡，本研究為抵抗PEDV新方法的研究提供了理論依據。

4 結 論

PEDV的感染上調了miR-133c-3p的表達，導致BCL-w表達水平降低，從而促進了細胞凋亡。