白細(xì)胞介素-33通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)調(diào)節(jié)兒童急性髓系白血病細(xì)胞中IL-4的表達(dá)

王一倩 朱澤鈺 侯寒漪 羅煥敏 虞紅嬌

摘要：目的：探究急性髓系白血病（AML）細(xì)胞如何通過(guò)白細(xì)胞介素-33（IL-33）影響骨髓（BM）微環(huán)境，從而促進(jìn)其生存的機(jī)制。方法：通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或細(xì)胞計(jì)數(shù)微珠陣列試劑盒測(cè)量IL-33、IL-4的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡定量磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、p38和GAPDH的表達(dá)。使用流式細(xì)胞儀通過(guò)凋亡評(píng)估細(xì)胞存活信號(hào)。通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR測(cè)量IL-4、Actb mRNA的表達(dá);結(jié)果：在診斷出的AML患者中，血清IL-33水平與IL-4水平相關(guān);從體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到，IL-33誘導(dǎo)的BM和外周血（PB）樣品中IL-4水平升高;IL-33以p38 MAPK依賴的方式增加了白血病細(xì)胞中IL-4的表達(dá)。結(jié)論：為IL-33信號(hào)傳導(dǎo)在AML發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵作用提供了證據(jù)。

關(guān)鍵詞：急性髓系白血病;白細(xì)胞介素-33;白細(xì)胞介素-4;P38絲裂原活化蛋白激酶通路

急性髓細(xì)胞性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一種遺傳異質(zhì)性克隆惡性腫瘤，其特征是反復(fù)發(fā)生染色體重排，最終導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞在骨髓（Bone Marrow， BM）和外周血（Peripheral Blood， PB）中積累[1]。盡管近年來(lái)兒童AML的治療有所進(jìn)步，不到65%的患者在初次誘導(dǎo)緩解治療后的3年內(nèi)仍能夠存活[2]。但開(kāi)發(fā)新的替代方法對(duì)更有效地治療AML仍至關(guān)重要。腫瘤微環(huán)境能夠通過(guò)保護(hù)癌細(xì)胞免受抗癌藥和環(huán)境壓力的影響[3～4]。白血病細(xì)胞和BM微環(huán)境之間的相互作用關(guān)系一直是探究AML發(fā)展機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

IL-33是一種來(lái)自IL-1家族的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)宿主防御，免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)[5]。在表達(dá)慢性髓樣白血病（CML）的BCR-ABL中，IL-33信號(hào)傳導(dǎo)可通過(guò)促進(jìn)耐藥性促進(jìn)細(xì)胞存活，并且促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌[15]。表達(dá)融合基因Cbfb-MYH11 的原代小鼠AML細(xì)胞高度表達(dá)IL-33的受體，即白介素1受體樣1（interleukin-1 receptor like 1， IL1RL1）。隨后發(fā)現(xiàn)，向AML患者白血病細(xì)胞中加入IL-33能夠有效抑制凋亡，激活P38絲裂原活化蛋白激酶通路（p38 MAPK），并增加IL-4和IL-6 mRNA水平[6～8]。本實(shí)驗(yàn)以兒童AML白血病細(xì)胞為模型，探討AML患者細(xì)胞中IL-4的表達(dá)水平是否受IL-33的調(diào)節(jié)。

1材料與方法

1.1 材料

選取2020年4～12月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（倫理編號(hào)：2020-39500）確診的AML患者。采集初診兒童AML患者或者健康供者（HD）的血清樣本（1～2 ml），BM（2～3 ml）和PB（2～3 ml）來(lái)自新診斷的兒童AML患者和HD。采用人單個(gè)核細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞 （Mononuclear Cell， MNC）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

白血病細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI-1640和含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定AML初診患者和HD對(duì)照組的血清IL-33的水平。將樣品與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）綴合的抗體一起溫育，然后添加HRP底物TMB導(dǎo)致顯色。在過(guò)氧化物酶的催化作用下，TMB變成藍(lán)色，并使用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度，確定樣品的特定濃度。

1.4 流式細(xì)胞儀珠陣列

將50 μl上清液與50 μl捕獲珠在室溫下孵育1 h，然后將混合物與50 μl藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）檢測(cè)試劑在室溫下孵育2 h。然后將混合物用1 ml BD CBA洗滌緩沖液洗滌1次，以200 g沉淀5 min，重懸于300 μl洗滌緩沖液中。最后通過(guò)Beckman Coulter流式儀獲取數(shù)據(jù)，使用FCAP Array Software 3.0進(jìn)行分析。

1.5 Western Blot蛋白免疫印跡

將細(xì)胞沉淀重懸于已加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中，并在冰上孵育20 min，隨后在4℃以13000 rpm離心30 min，并收集上清液。采用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)節(jié)濃度至同一含量。采用SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后TBST洗2次。過(guò)夜孵育一抗（1：1000），Washing buffer洗3次后，室溫孵育1 h二抗（1∶5000），Washing buffer洗3次后，采用ECL顯影。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將細(xì)胞用冰冷的PBS洗2次后，加入總NA提取試劑，室溫裂解10 min，然后加入等體積的氯仿，劇烈振蕩30 s后，室溫靜置15 min，然后以12 000 r /min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入500 μl 冷的異丙醇溶液，上下振蕩1 min后室溫靜置10 min。高速12 000 r /min離心10 min，白色沉淀即為總RNA。采用cDNA合成試劑盒獲取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，得到的cDNA產(chǎn)物采用SYBR熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列為： IL-4（正向引物： 5'- CACAACTGAGAAGGAAACCTTCTG-3'，反向引物5'-CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC-3'）; Actb（正向引物： 5'-GGATGCAGAAGGAGATCACTG -3'，反向引物： 5'- CGATCCACACGGAGTACTTG-3'）[9～10]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究中的數(shù)據(jù)采用（±s）表示，數(shù)據(jù)采用Graphpad Prim 8軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用Student' s t -test，三組以上數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1 初診AML患者的血清IL-4濃度與IL-33濃度呈負(fù)相關(guān)

使用表達(dá)Cbfb-MYH11融合基因的敲入小鼠的AML細(xì)胞，與未處理的AML細(xì)胞相比，IL-33處理可提高IL-4 mRNA表達(dá)水平，表明IL-33 / IL1RL1通路可能通過(guò)誘導(dǎo)IL -4的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞活性。為了進(jìn)一步檢查AML中IL-33和IL-4之間的關(guān)系，測(cè)量了來(lái)自新診斷的AML患者IL-33、IL-4的血清濃度。結(jié)果表明，血清IL-4水平與基線水平的IL-33水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.640，P = 0.046）（見(jiàn)圖1）。為了進(jìn)一步評(píng)估IL-4水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系，將來(lái)收集患者的臨床隨訪研究非常重要。

2.2 IL-33調(diào)控原代AML細(xì)胞中IL-4的產(chǎn)生

IL-33可以刺激人肥大細(xì)胞中Th1，Th2細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[11]。為了確定IL-33是否調(diào)節(jié)AML患者樣本中的IL-4表達(dá)，用IL-33或與IL-33阻斷抗體聯(lián)合處理原代BM和PB MNC細(xì)胞，并在72 h后檢查IL-4的mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的細(xì)胞相比，IL-33的加入顯著誘導(dǎo)了IL-4 mRNA地表達(dá)。IL-33阻斷抗體的加入消除了BM和PB樣品中IL-33引起的IL-4基因轉(zhuǎn)錄的增加（見(jiàn)圖2A-B）。為了確定IL-33是否介導(dǎo)IL-4的分泌，測(cè)量了上述處理后上清液中IL-4的水平。根據(jù)CBA結(jié)果，與未處理的細(xì)胞相比，IL-33顯著增加了BM和PB細(xì)胞中IL-4的分泌，而IL-33阻斷抗體的加入則顯著降低了由IL-33誘導(dǎo)的IL-4的水平（見(jiàn)圖2C）。這些結(jié)果表明，AML細(xì)胞分泌的IL-4受IL-33調(diào)節(jié)，揭示了由IL-33 / IL1RL1途徑調(diào)節(jié)的抗凋亡機(jī)制。

2.3 在臨床AML樣本中IL-33通過(guò)p38 MAPK促進(jìn)IL-4表達(dá)

既往工作表明，IL-33通過(guò)激活p38 MAPK通路及抑制AML的凋亡，同時(shí)誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)和分泌。本實(shí)驗(yàn)中，將使用p38 MAPK途徑的特異性抑制劑SB203580（SB）來(lái)檢查p38 MAPK是否磷酸化調(diào)節(jié)AML臨床樣本中IL-4的產(chǎn)生。將特定濃度的外源IL-33單獨(dú)或聯(lián)合SB加入培養(yǎng)中的AML患者的BM和PB細(xì)胞中。72 h后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IL-33的治療誘導(dǎo)了p38 MAPK的磷酸化，加入SB后p38 MAPK的磷酸化顯著降低（見(jiàn)圖3A-B）。通過(guò)進(jìn)行CBA檢測(cè)上述處理組上清液中的IL-4水平發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，經(jīng)IL-33處理的細(xì)胞中IL-4水平顯著升高，而在BM和PB細(xì)胞中，與單獨(dú)使用IL-33處理相比，SB處理顯著降低了IL-4分泌水平。此外，通過(guò)進(jìn)行qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，SB處理可減輕BM樣品中由IL-33處理引起的IL-4 mRNA表達(dá)增加（見(jiàn)圖3C）。結(jié)果表明，p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)是AML臨床樣本中IL-33誘導(dǎo)的IL-4水平的重要途徑。

3討論

AML約占兒童白血病的20%，總生存率約為65～70%。盡管在過(guò)去十年中出現(xiàn)了新的治療方法，但AML仍與不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)AML的新替代療法非常重要。在AML中，在于骨髓中各種類型的細(xì)胞因子對(duì)幫助AML細(xì)胞存活和耐藥性起著非常重要的作用，包括IL-10、IL-1β、TNF-α [12～14]。 作為IL-1細(xì)胞因子家族的新成員，IL-33已被證明能通過(guò)白介素受體相關(guān)激酶M（IRAK-M）磷酸化作用以及結(jié)合激活脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（PIN1）促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）活化[15]。相關(guān)研究表明，AML患者的血清中IL-33水平相對(duì)于正常人顯著升高。IL-33同時(shí)促進(jìn)原代小鼠AML細(xì)胞中IL-4 mRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步探討IL-33介導(dǎo)的AML生存率的機(jī)制，探究血清中IL-4和IL-33水平之間的關(guān)系以及外源性IL-33治療是否調(diào)節(jié)AML患者BM及PB樣本IL-4表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)新診斷的AML患者血清IL-33水平與IL-4水平降低有關(guān)。由于獲取患者樣品的數(shù)量有限，只能推測(cè)IL-4的基線濃度與患者血清IL-33呈中等程度的負(fù)相關(guān)。因此，分析大量患者樣本以證實(shí)我們的假設(shè)十分必要。通過(guò)進(jìn)行CBA，結(jié)果顯示IL-33導(dǎo)致原代AML細(xì)胞IL-4基因表達(dá)以及分泌顯著增加。重要的是，p38 MAPK抑制劑可部分消除IL-33誘導(dǎo)的IL-4水平的升高。這些數(shù)據(jù)表明IL-33通過(guò)激活p38 MAPK途徑誘導(dǎo)IL-4表達(dá)。IL-4被證明可以通過(guò)激活STAT6和磷酸化NF-κB來(lái)抑制慢性淋巴細(xì)胞性白血病（CLL）細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究提供了IL-33可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-4表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞存活的證據(jù)。更重要的是，p38 MAPK可能確實(shí)在AML中通過(guò)IL-33 / IL1RL1軸調(diào)節(jié)IL-4表達(dá)和分泌中起關(guān)鍵作用。

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