白細胞介素-33通過激活p38 MAPK信號調節兒童急性髓系白血病細胞中IL-4的表達

王一倩 朱澤鈺 侯寒漪 羅煥敏 虞紅嬌

摘要：目的：探究急性髓系白血病（AML）細胞如何通過白細胞介素-33（IL-33）影響骨髓（BM）微環境，從而促進其生存的機制。方法：通過酶聯免疫吸附測定或細胞計數微珠陣列試劑盒測量IL-33、IL-4的表達水平。通過免疫印跡定量磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、p38和GAPDH的表達。使用流式細胞儀通過凋亡評估細胞存活信號。通過實時定量熒光PCR測量IL-4、Actb mRNA的表達;結果：在診斷出的AML患者中，血清IL-33水平與IL-4水平相關;從體外實驗中檢測到，IL-33誘導的BM和外周血（PB）樣品中IL-4水平升高;IL-33以p38 MAPK依賴的方式增加了白血病細胞中IL-4的表達。結論：為IL-33信號傳導在AML發生過程中的關鍵作用提供了證據。

關鍵詞：急性髓系白血病;白細胞介素-33;白細胞介素-4;P38絲裂原活化蛋白激酶通路

急性髓細胞性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一種遺傳異質性克隆惡性腫瘤，其特征是反復發生染色體重排，最終導致骨髓祖細胞在骨髓（Bone Marrow， BM）和外周血（Peripheral Blood， PB）中積累[1]。盡管近年來兒童AML的治療有所進步，不到65%的患者在初次誘導緩解治療后的3年內仍能夠存活[2]。但開發新的替代方法對更有效地治療AML仍至關重要。腫瘤微環境能夠通過保護癌細胞免受抗癌藥和環境壓力的影響[3～4]。白血病細胞和BM微環境之間的相互作用關系一直是探究AML發展機制的研究熱點。

IL-33是一種來自IL-1家族的細胞因子，可調節宿主防御，免疫調節和炎癥反應[5]。在表達慢性髓樣白血病（CML）的BCR-ABL中，IL-33信號傳導可通過促進耐藥性促進細胞存活，并且促進細胞因子的分泌[15]。表達融合基因Cbfb-MYH11 的原代小鼠AML細胞高度表達IL-33的受體，即白介素1受體樣1（interleukin-1 receptor like 1， IL1RL1）。隨后發現，向AML患者白血病細胞中加入IL-33能夠有效抑制凋亡，激活P38絲裂原活化蛋白激酶通路（p38 MAPK），并增加IL-4和IL-6 mRNA水平[6～8]。本實驗以兒童AML白血病細胞為模型，探討AML患者細胞中IL-4的表達水平是否受IL-33的調節。

1材料與方法

1.1 材料

選取2020年4～12月在廣州市婦女兒童醫療中心（倫理編號：2020-39500）確診的AML患者。采集初診兒童AML患者或者健康供者（HD）的血清樣本（1～2 ml），BM（2～3 ml）和PB（2～3 ml）來自新診斷的兒童AML患者和HD。采用人單個核細胞分離液分離出單個核細胞 （Mononuclear Cell， MNC）。

1.2 細胞培養

白血病細胞培養液為RPMI-1640和含體積分數為10%的FBS，于37℃、體積分數為5% CO2的培養箱中培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.3 酶聯免疫吸附測定

根據產品說明書分別測定AML初診患者和HD對照組的血清IL-33的水平。將樣品與辣根過氧化物酶（HRP）綴合的抗體一起溫育，然后添加HRP底物TMB導致顯色。在過氧化物酶的催化作用下，TMB變成藍色，并使用酶標儀在450 nm下測量每個孔的吸光度，確定樣品的特定濃度。

1.4 流式細胞儀珠陣列

將50 μl上清液與50 μl捕獲珠在室溫下孵育1 h，然后將混合物與50 μl藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）檢測試劑在室溫下孵育2 h。然后將混合物用1 ml BD CBA洗滌緩沖液洗滌1次，以200 g沉淀5 min，重懸于300 μl洗滌緩沖液中。最后通過Beckman Coulter流式儀獲取數據，使用FCAP Array Software 3.0進行分析。

1.5 Western Blot蛋白免疫印跡

將細胞沉淀重懸于已加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中，并在冰上孵育20 min，隨后在4℃以13000 rpm離心30 min，并收集上清液。采用 BCA 法測定蛋白濃度，調節濃度至同一含量。采用SDS-PAGE進行凝膠電泳，再轉移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后TBST洗2次。過夜孵育一抗（1：1000），Washing buffer洗3次后，室溫孵育1 h二抗（1∶5000），Washing buffer洗3次后，采用ECL顯影。

1.6 實時熒光定量PCR

將細胞用冰冷的PBS洗2次后，加入總NA提取試劑，室溫裂解10 min，然后加入等體積的氯仿，劇烈振蕩30 s后，室溫靜置15 min，然后以12 000 r /min離心10 min，吸取上清液轉移到新的離心管中。加入500 μl 冷的異丙醇溶液，上下振蕩1 min后室溫靜置10 min。高速12 000 r /min離心10 min，白色沉淀即為總RNA。采用cDNA合成試劑盒獲取反轉錄產物，得到的cDNA產物采用SYBR熒光定量PCR試劑盒擴增檢測基因的相對表達水平，引物序列為： IL-4（正向引物： 5'- CACAACTGAGAAGGAAACCTTCTG-3'，反向引物5'-CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC-3'）; Actb（正向引物： 5'-GGATGCAGAAGGAGATCACTG -3'，反向引物： 5'- CGATCCACACGGAGTACTTG-3'）[9～10]。

1.7 統計學分析

研究中的數據采用（±s）表示，數據采用Graphpad Prim 8軟件進行作圖和統計分析。兩組間比較采用Student' s t -test，三組以上數據采用one-way ANOVA，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果與分析

2.1 初診AML患者的血清IL-4濃度與IL-33濃度呈負相關

使用表達Cbfb-MYH11融合基因的敲入小鼠的AML細胞，與未處理的AML細胞相比，IL-33處理可提高IL-4 mRNA表達水平，表明IL-33 / IL1RL1通路可能通過誘導IL -4的表達來調節白血病細胞活性。為了進一步檢查AML中IL-33和IL-4之間的關系，測量了來自新診斷的AML患者IL-33、IL-4的血清濃度。結果表明，血清IL-4水平與基線水平的IL-33水平呈負相關（r = -0.640，P = 0.046）（見圖1）。為了進一步評估IL-4水平與患者預后之間的關系，將來收集患者的臨床隨訪研究非常重要。

2.2 IL-33調控原代AML細胞中IL-4的產生

IL-33可以刺激人肥大細胞中Th1，Th2細胞因子和趨化因子的產生，從而促進炎癥反應[11]。為了確定IL-33是否調節AML患者樣本中的IL-4表達，用IL-33或與IL-33阻斷抗體聯合處理原代BM和PB MNC細胞，并在72 h后檢查IL-4的mRNA表達。結果發現，與未處理的細胞相比，IL-33的加入顯著誘導了IL-4 mRNA地表達。IL-33阻斷抗體的加入消除了BM和PB樣品中IL-33引起的IL-4基因轉錄的增加（見圖2A-B）。為了確定IL-33是否介導IL-4的分泌，測量了上述處理后上清液中IL-4的水平。根據CBA結果，與未處理的細胞相比，IL-33顯著增加了BM和PB細胞中IL-4的分泌，而IL-33阻斷抗體的加入則顯著降低了由IL-33誘導的IL-4的水平（見圖2C）。這些結果表明，AML細胞分泌的IL-4受IL-33調節，揭示了由IL-33 / IL1RL1途徑調節的抗凋亡機制。

2.3 在臨床AML樣本中IL-33通過p38 MAPK促進IL-4表達

既往工作表明，IL-33通過激活p38 MAPK通路及抑制AML的凋亡，同時誘導的IL-6表達和分泌。本實驗中，將使用p38 MAPK途徑的特異性抑制劑SB203580（SB）來檢查p38 MAPK是否磷酸化調節AML臨床樣本中IL-4的產生。將特定濃度的外源IL-33單獨或聯合SB加入培養中的AML患者的BM和PB細胞中。72 h后發現，與對照組相比，IL-33的治療誘導了p38 MAPK的磷酸化，加入SB后p38 MAPK的磷酸化顯著降低（見圖3A-B）。通過進行CBA檢測上述處理組上清液中的IL-4水平發現，與未經處理的細胞相比，經IL-33處理的細胞中IL-4水平顯著升高，而在BM和PB細胞中，與單獨使用IL-33處理相比，SB處理顯著降低了IL-4分泌水平。此外，通過進行qRT-PCR發現，SB處理可減輕BM樣品中由IL-33處理引起的IL-4 mRNA表達增加（見圖3C）。結果表明，p38 MAPK信號傳導是AML臨床樣本中IL-33誘導的IL-4水平的重要途徑。

3討論

AML約占兒童白血病的20%，總生存率約為65～70%。盡管在過去十年中出現了新的治療方法，但AML仍與不良預后密切相關。因此，開發針對AML的新替代療法非常重要。在AML中，在于骨髓中各種類型的細胞因子對幫助AML細胞存活和耐藥性起著非常重要的作用，包括IL-10、IL-1β、TNF-α [12～14]。 作為IL-1細胞因子家族的新成員，IL-33已被證明能通過白介素受體相關激酶M（IRAK-M）磷酸化作用以及結合激活脯氨酰順反異構酶（PIN1）促進樹突狀細胞（DC）活化[15]。相關研究表明，AML患者的血清中IL-33水平相對于正常人顯著升高。IL-33同時促進原代小鼠AML細胞中IL-4 mRNA的表達。為進一步探討IL-33介導的AML生存率的機制，探究血清中IL-4和IL-33水平之間的關系以及外源性IL-33治療是否調節AML患者BM及PB樣本IL-4表達。

研究發現新診斷的AML患者血清IL-33水平與IL-4水平降低有關。由于獲取患者樣品的數量有限，只能推測IL-4的基線濃度與患者血清IL-33呈中等程度的負相關。因此，分析大量患者樣本以證實我們的假設十分必要。通過進行CBA，結果顯示IL-33導致原代AML細胞IL-4基因表達以及分泌顯著增加。重要的是，p38 MAPK抑制劑可部分消除IL-33誘導的IL-4水平的升高。這些數據表明IL-33通過激活p38 MAPK途徑誘導IL-4表達。IL-4被證明可以通過激活STAT6和磷酸化NF-κB來抑制慢性淋巴細胞性白血病（CLL）細胞凋亡。

綜上所述，本研究提供了IL-33可能通過調節IL-4表達來調節白血病細胞存活的證據。更重要的是，p38 MAPK可能確實在AML中通過IL-33 / IL1RL1軸調節IL-4表達和分泌中起關鍵作用。

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