LAPTM4B-35蛋白作為肝癌血清學(xué)診斷新標(biāo)志物的探討

龐 泳，張 沙，楊 華，周柔麗

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系， 北京 100191)

LAPTM4B-35是北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)研究室發(fā)現(xiàn)、克隆并鑒定的一個(gè)新的人類LAPTM4B基因(NCBI GenBank NM-018407，Gene ID=55353)編碼的蛋白質(zhì)同型分子之一[1]。經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫印跡分析(Wes-tern blot)表明，LAPTM4B-35蛋白分別在 71.8% (51/71)和76.9% (50/65)的人肝癌組織中表達(dá)水平升高2倍以上，其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度(病理分級(jí))、轉(zhuǎn)移和耐藥性呈正相關(guān)，與患者的術(shù)后存活期呈負(fù)相關(guān)；多因素回歸分析表明，LAPTM4B-35蛋白是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子[2-3]。更有意義的是，LAPTM4B-35蛋白的過表達(dá)還與肝癌這一高復(fù)發(fā)腫瘤的復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)[3]。可見，LAPTM4B-35蛋白可能是一個(gè)肝癌診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷的新標(biāo)志物。我們的前期研究還表明，LAPTM4B-35蛋白的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤生成[4-5]，促進(jìn)細(xì)胞的生長失控、遷移、侵襲潛能增強(qiáng)[6]和多藥耐藥[7]。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)敲低腫瘤內(nèi)源性LAPTM4B基因及其編碼的LAPTM4B-35蛋白可抑制裸鼠體內(nèi)人肝細(xì)胞癌移植物的生長和轉(zhuǎn)移[8]，因此LAPTM4B-35蛋白可能是一個(gè)重要的腫瘤治療新靶標(biāo)。

很多腫瘤標(biāo)志物的血清學(xué)檢測(cè)是通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法進(jìn)行的。ELISA所檢測(cè)的血清抗原多為可溶性蛋白質(zhì)，而LAPTM4B-35是一個(gè)4次穿膜的蛋白質(zhì)[1]，因結(jié)構(gòu)中含4個(gè)疏水性的穿膜結(jié)構(gòu)域而具有很強(qiáng)的親脂性，用去垢劑處理細(xì)胞裂解液時(shí)，其存在于去垢劑相而非水相[9]，因此，欲建立適用的血清學(xué)檢測(cè)方法就需要了解其在血液中的存在形式。

近年的大量研究表明，脂類和蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜中并非均勻分布而是組裝成不同成分、不同特性和不同功能的微區(qū)。細(xì)胞表面的膜微區(qū)經(jīng)內(nèi)化形成(胞)內(nèi)體，進(jìn)而或再循環(huán)至細(xì)胞表面，或形成晚期內(nèi)體/多泡體，多泡體可與質(zhì)膜融合而釋放多泡體內(nèi)的小膜泡到細(xì)胞外，如此釋放的小膜泡稱為外排體(exosome)。各種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都釋放多種由不同分子組成的外排體，因此可存在于血液、尿液、羊水、胸水和腹水中。各種外排體均具有一些共同的特性，如直徑在30～100 nm、具有相同的密度和脂雙層膜、具有共同的和細(xì)胞類型特異的蛋白質(zhì)位于其膜中或腔內(nèi)。在外排體膜中最普遍存在的是4次穿膜蛋白質(zhì)[10-11]。外排體含有其來源細(xì)胞所特有的蛋白質(zhì)，來自于腫瘤細(xì)胞的則含有腫瘤相關(guān)抗原，因而可用于腫瘤的診斷或作為腫瘤疫苗[12-18]。

本文通過ELISA和Western blot方法鑒定肝癌患者血清中和肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中是否存在LAPTM4B-35蛋白，旨在探討體內(nèi)生長的惡性腫瘤細(xì)胞是否釋放LAPTM4B-35抗原到血液中以及其在血液中的存在形式，為建立血清學(xué)定量檢測(cè)診斷方法奠定基礎(chǔ)，并探討LAPTM4B-35蛋白作為肝癌診斷新標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 材料

BEL-7402人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系由本研究室保存，針對(duì)LAPTM4B-35蛋白兩個(gè)表位的多抗(LAPTM4B-N10-pAb和LAPTM4B-EC2-pAb)由本研究室用鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)耦聯(lián)的兩個(gè)10肽抗原免疫兔制備抗血清，并經(jīng)Protein A和抗原-親和柱純化為高親和性的IgG。LAPTM4B-EC1-mAb由北京晶美生物技術(shù)公司制備，BSA-EC2-10肽抗原由中國科學(xué)院化學(xué)研究所合成及耦聯(lián)。

肝癌組織(手術(shù)切除標(biāo)本)和患者血清由中國人民解放軍第302醫(yī)院(現(xiàn)名中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)肝膽外科提供，新鮮組織于手術(shù)離體后立即放入液氮中冷凍，然后置-80 ℃凍存。

應(yīng)用的儀器和試劑包括：100 ku MWCO Centriplus離心超濾管(Millipore公司)、96孔酶標(biāo)板(Nunc公司)、DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)、新生牛血清(Biochrom，德國)、重水(美國CIL，國內(nèi)分裝)、考馬斯亮藍(lán)G250和R250(Sigma公司)、NC硝酸纖維素膜(Whatman公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce公司)、BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)、Purified mouse anti-Integrin α5 MAb(BD公司)、Goat Anti-Rabbit IgG-HRP和Goat Anti-mouse IgG-HRP(Santa Cruz 公司)。

細(xì)胞裂解液：Tris-Cl (pH 7.6) 10 mmol/L、NaCl 150 mmol/L、EDTA 1 mmol/L、0.5%(體積分?jǐn)?shù))NP40、PMSF 1 mmol/L、aprotinin 1 mg/L、Pepstatin A 1 mg/L。

ELISA包被緩沖液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，封閉液為含3%(體積分?jǐn)?shù))BSA的PBS溶液(pH 7.4)，洗板液為含0.05%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20的PBS溶液(pH 7.4)，稀釋液為含1%(體積分?jǐn)?shù))BSA的PBS溶液(pH 7.4)，底物反應(yīng)液為0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)，反應(yīng)終止液為4 mol/L H2SO4。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

BEL-7402人肝細(xì)胞癌細(xì)胞用內(nèi)含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素、鏈霉素，10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.3 總蛋白的提取

1.3.1細(xì)胞總膜蛋白的提取 取長勢(shì)良好的細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))粗胰酶消化，離心，棄去上清液，在細(xì)胞沉淀中加入適量預(yù)冷的含去垢劑的細(xì)胞裂解液，于1 200 W功率、冰浴中間斷超聲處理共2 min (實(shí)際超聲1 min)，然后置于冰浴中30～60 min。于12 000×g、4 ℃下離心15 min以去除細(xì)胞碎片，上清液中含細(xì)胞的總膜蛋白，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2組織總膜蛋白的提取 將凍存的經(jīng)組織病理確診為肝細(xì)胞癌的腫瘤組織置于冰上，用剪刀剪成小碎塊，挑取約0.1 g濕重組織放入手動(dòng)玻璃勻漿器中，每管加入1 mL預(yù)冷的含去垢劑的細(xì)胞裂解液，于冰浴中充分勻漿，超聲處理及之后的操作同上。

1.4 外排體的分離與純化

將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液500 mL經(jīng)300×g、4 ℃離心10 min，去除細(xì)胞取上清液；1 200×g、4 ℃離心10 min，去除死細(xì)胞，收集上清液；10 000×g、4 ℃離心20 min，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。經(jīng)100 ku MWCO Centriplus 離心超濾管超濾濃縮(1 200×g、4 ℃離心45 min)得到10 mL濃縮液，將濃縮液均分為4份，每份用PBS溶液稀釋補(bǔ)足至4 mL并混勻，然后移至5 mL超速離心管中，該管底鋪有1 mL用重水配置的30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖墊，經(jīng)100 000×g、4 ℃超速離心45 min，收集底部的液體1.5 mL，再連續(xù)兩次使用PBS溶液稀釋至5 mL，同等條件下超速離心，收集底部含外排體的沉積物，用PBS稀釋至2.5 mL，作為外排體提取物置于-80 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

1.5 外排體所含蛋白質(zhì)的定量測(cè)定

使用Bradford法檢測(cè)外排體的蛋白質(zhì)濃度。

1.6 分離蛋白質(zhì)組分

取外排體懸液30 μL或同等蛋白質(zhì)含量的BEL-7402細(xì)胞膜提取物，加入適量的4×上樣緩沖液，100 ℃煮沸3 min，上樣于10%(體積分?jǐn)?shù))的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離膠的頂部，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后使用凝膠成像系統(tǒng)掃描，并用Scion Image對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析。

1.7 Western blot分析

取肝癌患者血清5 μL、或正常人血清5 μL、或外排體懸液60 μL及同等蛋白質(zhì)含量的肝癌組織膜提取物，于SDS-PAGE電泳后，將分離膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入anti-LAPTM4B-N10pAb或anti-Integrin α5 mAb作為一抗，分別按照體積比1 ∶1 000、1 ∶2 000稀釋，4 ℃孵育過夜。分別加入Goat Anti-Rabbit IgG-HRP、Goat Anti-mouse IgG-HRP(體積比1 ∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行放射自顯影并掃描結(jié)果。

1.8 ELISA直接法分析肝癌細(xì)胞釋放的外排體及肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白

用包被液將BSA-EC2-10肽以體積比1 ∶1 000稀釋(原液濃度為1 g/L)，外排體提取物原液及肝癌患者血清按照體積比1 ∶10稀釋(即原液10 μL，包被液90 μL)后包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，4 ℃孵育過夜。用3%(體積分?jǐn)?shù))BSA于37 ℃封閉2 h后，加入LAPTM4B-EC2-pAb作為一抗(體積比1 ∶1 000稀釋)37 ℃孵育1.5 h，加入Goat Anti-Rabbit IgG-HRP作為二抗(體積比1 ∶2 000稀釋)37 ℃孵育40 min，其余步驟按照常規(guī)的直接法ELISA程序操作，但洗板時(shí)動(dòng)作要輕柔，最后測(cè)定光密度(D492 nm)并分析結(jié)果。

1.9 ELISA夾心法分析正常人和原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白

以Anti-LAPTM4B-N10-pAb為捕獲抗體包被酶標(biāo)板(1 mg/L)，置于4 ℃過夜，封閉2 h，常規(guī)洗板4次(用PBST洗3次，第4次用雙蒸水洗，每孔300 μL，每次3 min)，然后加入血清50 μL/孔，于37 ℃孵育2 h，洗板后加入檢測(cè)抗體Anti-EC1-mAb(100 μL/孔)，于37 ℃孵育1.5 h，洗板4次后加入新鮮配制的底物反應(yīng)液(100 μL/孔)，于37 ℃避光顯色至空白D492 nm的讀數(shù)值控制在1.0左右，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，加50 μL/孔，震蕩混勻，測(cè)定492 nm處光密度值(D492 nm)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，等級(jí)資料以中位數(shù)(最小值，最大值)表示，組間兩兩比較采用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者血液中LAPTM4B-35蛋白的鑒定

2.1.1Western blot鑒定肝癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白 用自制、純化的anti-LAPTM4B-N10pAb多抗對(duì)肝癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，不論是肝癌患者還是正常人血清中都含有LAPTM4B-35蛋白，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白似乎高于正常人(圖1)。

2.1.2ELISA直接法鑒定肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白 直接以肝癌患者的血清或化學(xué)合成的BSA-EC2-10肽多價(jià)抗原包被酶標(biāo)板，用LAPTM4B-EC2-pAb多抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)，與Wes-tern blot結(jié)果一致，ELISA直接法檢測(cè)的肝癌患者血清中存在LAPTM4B-35抗原，且含量顯著高于陰性對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001, 圖2)。但是，LAPTM4B-35含量低于BSA-EC2-10肽抗原的陽性對(duì)照組，其原因一方面可能由于外排體中含有多種蛋白質(zhì)，LAPTM4B-35蛋白只占其中的一部分，而BSA-EC2-10肽是多價(jià)的純抗原，故可與抗體結(jié)合的有效抗原濃度差別很大；另一方面可能由于血液中的LAPTM4B-35蛋白并非可溶性分子，而以外排體形式存在，以致其被酶標(biāo)板表面吸附的效率和牢度不如可溶性的合成抗原短肽。

2.2 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外排體蛋白質(zhì)定量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式:y=0.012 4x+0.085 3,計(jì)算出肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的外排體提取物中蛋白質(zhì)濃度約為0.969 0 g/L。

2.3 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外排體的SDS-PAGE分析譜

以SDS-PAGE分析肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外排體的蛋白質(zhì)組分，結(jié)果見圖3。在蛋白質(zhì)總量相等的情況下，來源于BEL-7402肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的外排體蛋白質(zhì)組分總體上比細(xì)胞膜總提取物的蛋白質(zhì)組分簡單，其中有的成分得到富集，有的成分有所減少，表明外排體中的蛋白質(zhì)組分與細(xì)胞膜總提取物中的組分不同。

P1 and P2, serum from HCC patients; H1, serum from normal indivi-dual.圖1 Western blot分析正常人與肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白的表達(dá)Figure 1 Western blot analysis of LAPTM4B-35 protein in serum of healthy individual and hepatocellular carcinoma patients

* P<0.001, serum group vs. blank control group.圖2 ELISA直接法分析肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白的表達(dá)Figure 2 Direct ELISA analysis of LAPTM4B-35 protein in serum of hepatocellular carcinoma patients

1, molecular marker; 2, cellular extracts; 3, exosomes.圖3 SDS-PAGE分析BEL-7402肝癌細(xì)胞來源的外排體和細(xì)胞膜提取物中的蛋白質(zhì)組分Figure 3 SDS-PAGE profiles of cellular extracts and exosomes from BEL-7402 hepatocellular carcinoma cells

2.4 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的外排體中所含LAPTM4B-35蛋白

采用Western blot分析LAPTM4B-35蛋白在肝癌組織膜提取物和BEL-7402肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液來源的外排體中的表達(dá)，結(jié)果表明二者均存在LAPTM4B-35蛋白，其在肝癌組織膜提取物中的表達(dá)量高于外排體(圖4)。

2.5 ELISA檢測(cè)肝癌細(xì)胞釋放的外排體中的LAPTM4B-35蛋白

直接用外排體提取液或BSA-EC2-10肽包被96孔板，使用LAPTM4B-EC2-pAb進(jìn)行檢測(cè)，得到陽性結(jié)果，即外排體中含有LAPTM4B-35蛋白。BSA-EC2-10肽對(duì)照組的D492 nm為0.944 7±0.105 5，外排體組的D492 nm為0.594 3±0.111 1(空白對(duì)照組的D492 nm為0.106 0±0.015 5)。

1 and 2, tumor tissues; 3 and 4, exosomes.圖4 Western blot鑒定LAPTM4B-35蛋白在肝癌組織膜提取物和來源于BEL-7402肝癌細(xì)胞外排體中的表達(dá)Figure 4 Western blot profiles of LAPTM4B-35 protein in membrance extracts from hepatocellular carcinoma tissues and exosomes from BEL-7402 hepatocellular carcinoma cells

外排體組的包被蛋白質(zhì)總量遠(yuǎn)高于BSA-EC2-10肽組(10.0 ∶0.1 μg)，但是前者的D492 nm值約為后者的2/3，一方面是因?yàn)樵谕馀朋w中還含有LAPTM4B-35蛋白以外的其他蛋白質(zhì)，另一方面是因?yàn)橥馀朋w以小囊泡的形式存在，不容易被96孔板吸附，而且在洗板時(shí)容易脫落。

圖5結(jié)果顯示，ELISA直接法檢測(cè)肝癌細(xì)胞釋放的外排體中的LAPTM4B-35蛋白含量顯著高于空白對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

* P<0.001, exosomes group vs. blank control group.圖5 ELISA直接法鑒定外排體中的LAPTM4B-35蛋白Figure 5 LAPTM4B-35 protein in exosomes identified by direct ELISA

2.6 ELISA檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者和正常人血清中的LAPTM4B-35蛋白

采用以Anti-LAPTM4B-N10-pAb為捕獲抗體，以anti-EC1-mAb為檢測(cè)抗體的ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)33例正常人和43例肝細(xì)胞癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白，結(jié)果顯示，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白含量顯著高于正常人，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6，P<0.001)。

P<0.001, normal vs. HCC. Normal, normal individuals (n=33); HCC, hepatocellular carcinoma patients (n=43).圖6 ELISA夾心法檢測(cè)正常人和肝癌患者血清中LAPTM4B-35蛋白水平Figure 6 LAPTM4B-35 protein levels in serum from normal individuals and hepatocellular carcinoma patients detected by sandwich ELISA

3 討論

在世界范圍肝癌占腫瘤死亡的第4位或第5位，在中國為第3位，某些地區(qū)為第1位。每年全球肝癌新發(fā)病例84.1萬，中國新發(fā)病例39.3萬，占全球肝癌新發(fā)病例的46.7%，每年全球因肝癌死亡病例78.2萬，中國為36.9萬，占全球肝癌死亡病例的47.2%，而且發(fā)病年齡也趨于年輕化。肝癌的治愈率低而復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅人們健康。肝癌治愈率低的主要原因之一是缺乏早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的靈敏指標(biāo)。影像診斷的準(zhǔn)確性高而靈敏度低，組織病理診斷是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)但需要有創(chuàng)采得腫瘤組織。目前廣泛采用的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)靈敏度高而特異性不夠，其假陰性和假陽性率均為30%，因此，迫切需要探索新的肝癌診斷標(biāo)志物。本研究室發(fā)現(xiàn)、克隆和鑒定的LAPTM4B基因編碼的LAPTM4B-35蛋白在76.9%的肝癌組織中表達(dá)上調(diào)2倍以上，61.5%上調(diào)4倍以上，其表達(dá)水平與肝癌的惡性度、生長速度、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、多藥耐藥以及患者的術(shù)后存活期等均有良好相關(guān)性，而且是一個(gè)很好的獨(dú)立預(yù)后因子和治療靶標(biāo)[20]。本文通過Western blot和ELISA法檢測(cè)到肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中存在含LAPTM4B-35蛋白的外排體，兩種方法都表明肝癌患者的血液中也存在LAPTM4B-35蛋白，鑒于其不溶于水的親脂性，推測(cè)其存在形式可能也是外排體。

關(guān)于外排體的生物生成、釋放和生物學(xué)活性以及在疾病診斷與治療上的應(yīng)用近年頗受重視，近年的相關(guān)研究數(shù)量很多。血液、尿液及各種分泌物中外排體的檢測(cè)和應(yīng)用已引起醫(yī)學(xué)界關(guān)注，被認(rèn)為在腫瘤診斷和治療中有良好的應(yīng)用前景，特別是在前列腺癌[13]、卵巢癌[14]和鼻咽癌[15]的診斷中。然而，由于外排體是不均一的小囊泡而非可溶性分子，而且整合在外排體中的膜分子存在方向性，在建立ELISA檢測(cè)方法上難度較大。

本研究采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)結(jié)果表明，肝癌患者血清中的LAPTM4B-35蛋白水平顯著高于正常人，為建立適用于臨床血清學(xué)診斷的方法奠定了基礎(chǔ)。由于觀察時(shí)間短，對(duì)于患者血清中的LAPTM4B-35蛋白水平與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚難得出結(jié)論。應(yīng)用這種檢測(cè)方法診斷肝癌的特異性和靈敏度，以及與AFP相比的優(yōu)劣情況，有待進(jìn)行更大樣本量的分析以得出結(jié)論。

2019年美國MyBio Source Inc.公司推出了檢測(cè)LAPTM4B-35蛋白的ELISA試劑盒，德國明斯特(Münster)大學(xué)醫(yī)院與武漢大學(xué)肝膽疾病研究院合作使用該試劑盒檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌患者(169例)、慢性胰腺炎患者(40例)和正常人(30例)血清中LAPTM4B-35蛋白的水平，結(jié)果表明，LAPTM4B-35蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤組織和患者血清中的表達(dá)水平比正常人和慢性胰腺炎患者顯著增加，且血液中LAPTM4B-35蛋白水平低的患者術(shù)后無復(fù)發(fā)存活期和總存活時(shí)間較長[21]。這項(xiàng)研究為采用ELISA方法檢測(cè)血液中LAPTM4B-35蛋白水平的可行性和以其作為某些惡性腫瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物提供了進(jìn)一步的佐證。

[志謝：感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院肝膽外科吳健雄主任和劉立國醫(yī)生、中國人民解放軍第302醫(yī)院(現(xiàn)名中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)肝膽外科劉振文主任和齊瑞兆醫(yī)生以及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科張青云主任對(duì)本研究提供的幫助]。