載藥脂質體修飾的聚醚醚酮植入物的抑菌和骨整合性能

王立新，許 曉，倪耀豐，孫海濤，余日月，魏世成

(1. 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院口腔科， 北京 100038； 2. 北京大學口腔醫學院·口腔醫院，口腔頜面外科 國家口腔醫學中心 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室， 北京 100081)

目前應用較為廣泛的骨替代修復材料主要包括純鈦及鈦合金等醫用金屬材料和聚醚醚酮(polyetheretherketone，PEEK)等高分子材料，其中PEEK具有多種優越的性能，尤其是其彈性模量與人體皮質骨的彈性模量較接近，可以降低應力屏蔽現象，避免可能的骨損傷[1-2]。但PEEK是生物惰性材料，在體內不能發揮生物活性，進而影響了植入物-骨界面的骨整合。影響植入物-骨界面骨整合的因素很多，當前研究認為主要包括植入物表面的促成骨活性和感染[3-4]。因此，為了拓寬PEEK在骨科、口腔科等領域的臨床應用前景，必須提高惰性PEEK的成骨活性，同時使其能預防細菌污染。既往文獻報道，最常用的方法是通過物理或化學方法制備生物活性涂層使PEEK功能化，許多涂層(包括羥基磷灰石、生物活性小分子、磷酸鈣、鈦等)在增強PEEK植入物的骨整合方面具有實用價值[5-7]，但這些方法仍然存在許多亟待解決的問題，包括化學步驟復雜耗時、涂層易降解、涂層與基底粘接不良等。

聚多巴胺(polydopamine，pDA)涂層是一種易于操作的表面改性方法。通過在弱堿性水環境中簡單浸泡方式，多巴胺幾乎可以在所有材料表面(無需預處理)形成結構穩定的pDA薄膜，而且pDA的鄰苯二酚結構可以進一步連接含氨基或巰基的生物活性分子，進而實現材料表面的二次修飾，該方法已被廣泛用于各種生物材料的功能化[8-9]。但pDA不適合直接固定進入細胞內發揮作用的生物活性小分子，如米諾環素(minocycline，Mino；一種廣譜四環素類抗生素)和地塞米松(dexamethasone，Dex；一種具有促成骨作用的糖皮質激素)[10-11]。目前，克服這一限制的策略主要是使用納米遞送系統，如脂質體(liposome，lipo)，其可攜帶、運輸和緩慢釋放生物活性小分子到細胞質中[12]。

結合以上研究背景，本研究提出PEEK表面功能化改性方案(圖1)：用脂質體作為藥物運輸載體同時包載Dex和Mino，然后進一步利用多巴胺的自聚合及邁克爾加成反應(Michael addition reaction)，將Dex/Mino脂質體共價接枝在PEEK表面；先對功能化的PEEK進行熒光表征，再將其植入體內，分別建立小鼠皮下植入感染模型和比格犬股骨植入模型，評價該表面修飾方法是否有效地提高了PEEK表面的抑菌和促成骨活性，為進一步將該材料用于臨床提供依據。

PEEK, polyetheretherketone; pDA, polydopamine; Dex, dexamethasone; Mino, minocycline； S. mutans, Streptococcus mutans.圖1 Dex/Mino脂質體功能化修飾的PEEK表面的制備及其體內骨整合性能(包括抑菌和促成骨活性)評價的示意圖Figure 1 Schematic illustration of the preparation of Dex/Mino liposome-decorated PEEK through pDA coating, as well as its bacteriostasis and osseointegration in vivo for load-bearing bone repairing

1 材料與方法

1.1 制備Dex/Mino脂質體

Dex/Mino脂質體按照薄膜分散法制備[13-14]。按照摩爾比例1.85 ∶1.00 ∶0.15 ∶0.25精密稱取相應的二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基和Dex于茄形瓶中，按照 1 ∶1(體積比)加入甲醇和氯仿的混合溶劑并搖動使溶質溶解；使用75 r/min的旋轉蒸發儀在47 ℃恒溫水浴中減壓干燥徹底除去有機溶劑，瓶內壁形成一層均勻的脂膜。取適量的水化液(120 mmol/L無水乙酸鈉和無水氯化鈣的混合液，pH=7.9)加入茄形瓶中，于47 ℃恒溫水浴中超聲水化，直至內壁脂膜完全脫落形成懸液；迅速將所得脂質體懸液依次通過孔徑為220 nm和100 nm的濾器擠出數次，即得到具有濃度梯度的Dex脂質體，使用 0.9%(質量分數)氯化鈉緩沖液過夜透析。透析后的 Dex 脂質體與適量Mino儲液(藥脂比為1 ∶10)混合，50 ℃條件下振搖茄形瓶30 min使Mino載入脂質體水相中，即得到Dex/Mino脂質體，使用磷酸鹽緩沖液過夜透析后4 ℃保存備用。

1.2 制備Dex/Mino脂質體修飾的PEEK

將純PEEK片(直徑10 mm，長度1 mm)和純PEEK種植體(直徑4 mm，長度7 mm)依次放置于丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗各2 h，50 ℃干燥后待用。將多巴胺粉末加入pH=8.5 的Tris緩沖液(10 mmol/L)中混勻得到多巴胺溶液(2 g/L)，然后將純PEEK片/純PEEK種植體放入多巴胺溶液中，在37 ℃條件下反應18 h，搖床設置為70 r/min，超聲清洗3次后將樣品命名為PEEK-pDA。37 ℃條件下將PEEK-pDA在Dex/Mino脂質體懸液(1 g/L)中靜置浸泡24 h，輕輕清洗3次后將樣品命名為PEEK-Dex/Mino lipo。

1.3 熒光脂質體修飾的PEEK表面的定性及定量檢測

本實驗在避光條件下完成。分別將純PEEK和PEEK-pDA片浸泡于1.0 g/L的熒光脂質體溶液中24 h，輕輕清洗3次，得到的樣品命名為PEEK非功能化(non-functionalized，NF)脂質體(PEEK-NF-lipo)和PEEK-pDA-lipo。使用激光共聚焦顯微鏡拍攝樣品表面脂質體分布情況；加入甲醇400 μL溶解化學接枝的脂質體(70 r/min，5 min)，取100 μL到96孔板中，使用酶標儀檢測PEEK表面脂質體的熒光接枝密度。

1.4 小鼠皮下植入感染模型建立

1.4.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡)，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級環境下飼養。本研究得到了北京大學動物倫理委員會的批準(批準號：LA2015149)。

1.4.2變形鏈球菌菌液準備 變形鏈球菌(UA159)由北京大學口腔醫院中心實驗室微生物平臺提供。培養方法：于-80 ℃冰箱取出甘油凍存菌，溶化后與Todd-Hewitt(TH)液體培養基混勻，使用螺旋接種儀將菌液復蘇于腦心浸液(brain heart infusion，BHI)固體培養基上，將培養皿倒置培養48 h，挑取一個單克隆于TH液體培養基(1 mL)中繼續培養24 h備用。

1.4.3手術植入及石蠟切片染色 實驗分兩組，每組兩只小鼠。將小鼠稱重，使用1%(質量分數)戊巴比妥鈉腹腔注射使其麻醉；將小鼠俯臥位固定，脫毛使皮膚充分暴露，常規消毒；使用組織剪剪開小鼠皮膚，鈍性分離形成皮下囊袋；使用加樣槍在兩組PEEK片表面分別接種10 μL變形鏈球菌(1×108CFU/mL)；將表面接種了細菌的PEEK片置于皮下，使用角針縫合皮膚；術后將小鼠放于37 ℃保溫臺上，觀察小鼠麻醉后蘇醒狀態。術后24 h，腹腔注射1%(質量分數)戊巴比妥鈉處死小鼠后取樣，組織塊于4%(質量分數)多聚甲醛中固定后流水沖洗，脫水透明，浸蠟并包埋形成蠟塊；使用石蠟切片機切片后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。

1.5 比格犬股骨植入模型建立

1.5.1實驗動物 三只健康的雄性比格犬，1.5年齡，體質量(11.2±0.6) kg，由北京瑪斯生物技術有限公司提供，在普通級環境下飼養。本研究得到了北京大學動物倫理委員會的批準(批準號：LA2018226)。

1.5.2比格犬股骨內種植體的植入 比格犬稱重，使用3%(質量分數)戊巴比妥鈉脛前靜脈注射使其全身麻醉。將比格犬側臥位固定于恒溫手術臺上，脫毛使皮膚充分暴露，常規消毒鋪巾；切開皮膚，切口處局部注射含腎上腺素的利多卡因，小心分離肌肉、血管，充分暴露股骨；使用高速渦輪機和直徑為4 mm的鉆針備洞，洞深達到7 mm，備洞過程中使用生理鹽水降溫；將樣本置于準備好的洞中，每個股骨隨機植入2～3個種植體，兩組分別植入8個種植體；依次用圓針和角針嚴密對位縫合肌肉和皮膚。術后及時觀察比格犬麻醉蘇醒狀態，連續3天肌肉注射10 U/kg青霉素鈉，留意觀察比格犬的傷口愈合情況，若出現紅腫或感染等癥狀則及時處理，第7天拆線。

1.5.3Micro-CT分析及硬組織切片染色 手術8周后，脛前靜脈注射3%(質量分數)戊巴比妥鈉處死，獲取股骨組織標本，將其放置于10%(質量分數)中性福爾馬林溶液中充分固定；利用Micro-CT掃描股骨樣本，使用Micro-CT分析軟件重建三維的骨質結構。Micro-CT完成后，修剪樣本，流水清洗，使用梯度乙醇對樣本脫水，將股骨樣本先后浸泡于滲透液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，然后置入包埋液中固定，使用硬組織修片機切割修整樣本，切片后進行HE染色。

1.6 統計學分析

使用Origin 8.0統計軟件對實驗結果進行分析處理；數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PEEK表面熒光脂質體接枝定性及定量分析

本實驗使用熒光檢測來評價脂質體是否共價修飾于PEEK表面，圖2為代表性的熒光圖像及其相對應的脂質體接枝強度定量。熒光標記的脂質體同時附著于PEEK-NF-lipo和PEEK-pDA-lipo上，PEEK-pDA-lipo組的紅色熒光強度強于PEEK-NF-lipo組，并在其表面均勻分散。定量結果進一步證實，由于pDA涂層的存在，更多熒光標記的脂質體被共價固定在PEEK表面，說明脂質體成功修飾于PEEK表面并在其表面均勻分布。

2.2 小鼠皮下PEEK片植入后抑菌作用的評價

本實驗將Dex/Mino脂質體修飾的PEEK(表面接種變形鏈球菌菌液)植入C57BL/6小鼠皮下，評估其體內抗菌活性和組織學反應。通過HE染色評估小鼠體內組織學反應發現，兩組樣品周圍的皮下組織中都有炎性細胞(圖3)，但與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組的炎性細胞數量較低，說明純PEEK組的感染嚴重程度高于功能化PEEK組，提示Dex/Mino脂質體修飾的PEEK在體內可有效地預防感染。

NF, non-functionalized; lipo, liposome. Other abbreviations as in Figure 1. *P<0.05.圖2 PEEK-NF-lipo組和PEEK-pDA-lipo組表面的熒光定性及定量分析(n=11)Figure 2 Qualitative and quantitative fluorescence analysis of PEEK-NF-lipo group and PEEK-pDA-lipo group (n=11)

2.3 比格犬股骨內PEEK植入后骨整合能力的評價

本研究建立了一個比格犬股骨植入模型，將功能化PEEK植入股骨骨髓腔(圖4A、B)，評價改性PEEK表面的骨整合能力。術后8周采用Micro-CT技術來評估骨樣本，可見純PEEK周圍的新生骨是不連續的、間斷的(圖4C)，而Dex/Mino脂質體修飾的PEEK周圍則形成更多連續的、致密的新骨(圖4D)；純PEEK組的新生骨容積比例(骨體積/總體積，bone volume/total volume，BV/TV)為 0.09，PEEK-Dex/Mino lipo組的BV/TV值為0.27。上述結果表明，與純PEEK相比，Dex/Mino脂質體修飾的PEEK顯著促進了新骨形成。HE染色結果顯示，純PEEK界面有新骨碎片，且與新骨組織的間隙較大；PEEK-Dex/Mino lipo組新骨形成比純PEEK組多，且牢固地結合在功能化修飾的PEEK表面，沿著PEEK界面延伸(圖5)，與Micro-CT結果一致。以上結果提示，Dex/Mino脂質體的修飾加速了骨沉積，促進了骨融合，Dex/Mino脂質體修飾的PEEK能更好地與宿主骨結合，促進新骨形成。

3 討論

由感染、創傷、炎癥、骨腫瘤等原因導致的骨缺損通常需要使用骨替代修復材料進行手術植入修復[15-18]。決定骨替代修復材料植入成功與否的關鍵是植入物-骨界面的骨整合，材料的表面性質決定了植入物與體內周圍組織整合的最終能力[19-20]。為了實現植入后的最佳骨整合，在不破壞PEEK眾多優點的前提下，采用表面改性方法增強PEEK表面的生物活性是首選途徑[1]。本研究以pDA涂層作中間介質，將Dex/Mino脂質體修飾到PEEK表面，使其表面功能化，熒光脂質體接枝定性及定量檢測提示脂質體已成功共價修飾在該表面，而且在該表面均勻分布。

由于植入物表面與周圍組織的界面易受細菌侵襲，如果感染得不到控制，可能會導致術后植入失敗，因此植入物表面的抑菌作用至關重要[21]。細菌在植入物界面上的初始粘附是感染的一個關鍵因素，也是生物膜形成的一個關鍵步驟，考慮到植入物的持久使用，在術后植入初期阻斷細菌對植入生物材料的粘附至關重要[22-23]。本研究通過建立小鼠皮下植入感染模型，評估功能化PEEK在體內的抑菌活性及組織學反應。HE染色結果顯示，與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組的炎性細胞浸潤程度較輕，即感染程度較輕，說明Dex/Mino脂質體修飾提高了惰性PEEK的抗感染活性，Mino的釋放在體內更有效地預防了感染發生。

骨整合會指引成骨細胞在植入物表面定植，合成細胞外骨基質，最終形成新骨[24-25]。研究體內組織細胞對Dex/Mino脂質體修飾的PEEK的反應是骨整合的重要指標之一，同時與本研究的PEEK材料是否能夠成為生物醫學植入物密切相關。本研究通過建立比格犬股骨植入模型，評估功能化PEEK的體內新骨生成及骨整合能力。Micro-CT及組織學分析結果顯示，與純PEEK組相比，PEEK-Dex/Mino lipo組促進更多新骨生成，而且功能化PEEK與新生骨牢固結合。既往研究指出，Dex修飾的納米顆粒或納米纖維可促進體外成骨相關蛋白表達及體內鈣化骨形成[26-27]，提示Dex/Mino脂質體涂層修飾PEEK后，脂質體中Dex的釋放必然促進骨髓腔中成骨細胞的生長及新骨再生。經Dex/Mino脂質體修飾后，Dex的釋放在體內更有效地刺激和引導了新骨再生。生物惰性PEEK周圍的新骨形成增加，進一步促進了PEEK與骨之間的骨化，提示Dex/Mino脂質體修飾的PEEK更有利于提高體內骨整合。

A, HE staining of mouse after subcutaneous implantation for 24 h; B, quantification of inflammatory cells in Figure A (×20). Abbreviations as in Figure 1 and 2. *P<0.05.圖3 小鼠皮下植入24 h后的組織切片HE染色及炎性細胞定量(n=5)Figure 3 HE staining and inflammatory cell quantification of mouse after subcutaneous implantation for 24 h (n=5)

A, a PEEK implant; B, macroscopic image of a beagle’s femur containing implants; C, micro-CT 3D reconstruction images of PEEK; D, micro-CT 3D reconstruction images of PEEK-Dex/Mino lipo.圖4 功能化PEEK植入比格犬股骨8周后的Micro-CT分析Figure 4 Micro-CT analysis of functionalized PEEK after 8 weeks of Beagle’s femur implantation

Abbreviations as in Figure 1 and 2.圖5 功能化PEEK植入比格犬股骨8周后的橫向示意圖及HE染色分析Figure 5 Schematic illustration of the transverse perspective and HE staining analysis of functionalized PEEK after 8 weeks of Beagle’s femur implantation

綜上所述，Dex/Mino脂質體修飾的PEEK在體內具有有效的抑菌和促進新骨再生的能力，作為牙科和骨科替代修復材料具有很大的臨床應用潛力。